LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN ISOLASI DNA KASAR

Nama NIM Kelompok Asisten

Disusun Oleh: : Aminatus Sholikah : 115040213111035 : kamis, 06.00-07.30 : Putu Shantiawan Prayoga

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN MALANG 2012

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia. Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai tujuan. Sebenarnya telah ada metode standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989). Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alatalat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA ( Etilendiamin tetra asetat ) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA. Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA. Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode Kitchen Preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur.

Isolasi DNA metode Kitchen Preparation menggunakan detergen sebagai alternative pengganti EDTA dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai pengganti enzim protease. Sedangkan bahan yang akan dilihat DNA nya adalah strowberi, hal ini dikarenakan strowberi mudah dihancurkan. Selain itu, strowberi matang menghasilkan enzim pectinase dan selulase yang membantu memecah dinding sel. Strowberi yang umum dibudidayakan adalah octoploid dengan delapan set genom. Hal ini sangat baik untuk menunjukkan ekstraksi DNA karena memiliki delapan dari setiap jenis kromosom yang juga dikatakan bahwa strowberi memiliki DNA yang berlimpah.
1.2 Tujuan - Untuk mengetahui Definisi Isolasi DNA. - Untuk mengetahui metode dan tahapan dalam isolasi DNA. - Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA.

1.3 Manfaat - Dapat mengetahui definisi isolasi DNA. - Dapat mengetahui metode dan tahapan dalam melakukan isolasi DNA. - Dapat mengetahui manfaat isolasi DNA.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 DefinisiIsolasi DNA

a. Isolasi DNA adalah proses mengidentifikasi DNA dari suatu

makhluk hidup dengan suatu proses ekstraksi DNA di dalam sel (Hatta, 2002). b. DNA isolation is the most important step in molecular biology analysis. Several DNA isolation techniques which are developed were expensive. Isolasi DNA merupakan tahap terpenting dalam analisis biologi molekuler. Teknik-teknik isolasi DNA yang telah dikembangkan sangat mahal dan memerplukan waktu yang lama (Listanto,1996). 2.2 Macam Metode Isolasi DNA

Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) dengan Nitrogen Cair. Metode I. Daun temulawak sebanyak 1 gram digerus dengan PVP dannitrogen cair hingga menjadi tepung. Sebanyak 10 mL bufer ekstraksi hangat dan 2.5 mL 2-merkaptoetanol ditambahkanke dalam sampel dan diinkubasi sambil digoyang perlahan pada suhu 55 C, kecepatan 150 rpm selama 1 jam. Selanjutnya diekstraksi ulang dengan kloroform:isoamil alkohol (24:1) sebanyak 10 mL. Selanjutnya, dilakukan pemisahan dengan sentrifugasi pada kecepatan 1000 g selama 5 menit. Aliquot yang terdapat pada bagian atas dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan isopropanol dingin sebanya 2/ volume. Kemudian diinversi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Pelet dikoleksi dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 20 menit. Pelet dicuci dengan buffer pencucii (etanol 76% dan ammonium asetat).

Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 14000 g selama 10 menit. Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali. Pelet yang telah dicuci selanjutnya ditambahkan dengan bufer TE dan ditambahkan RNAse A dengan konsentrasi final 10 ug/mL. RNAse A diaktivasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Selanjutnya, dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 12000 g selama 5 menit. Pelet yang dihasilkan diresuspensi dengan molecular water. Proteinase K ditambahkan dengan dua variasi penambahan. Metode Ekstraksi Modifikasi Doyle & Doyle (1990) tanpa Nitrogen Cair. Metode II. Sampel daun sebanyak 0.2 gram dan digerus dengan PVP dan 0.75 mL buffer ekstraksi (2% b/v CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8), 0.2% (v/v) 2merkaptoetanol). Inkubasi dilakukan dengan incubator shaker pada suhu 65C dengan 50 rpm selama satu jam. Sampel kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk proses cooling. Sampel ditambahkan 0.75 mL kloroform: isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan berisi DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan dengan 2/3 volume isopropanol dingin kemudian diinversi perlahan sebanyak 10 kali. Smapel tersebut disentrifugasi 11.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4oC. Pelet yang telah kering diberi 25 L molecular water dan disimpan pada suhu -20C. Metode Ekstraksi Modifikasi Zheng et al (1995). Metode III. Sampel daun 200 mg digerus hingga halus dan ditambahkan buffer ekstraksi (25 mM EDTA (pH 7.5), 50 mM TrisHCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, dan SDS 1%) sebanyak 400 L dalam mortar dingin. Sampel ditambahkan

100 L buffer ekstraksi di dalam tabung dingin dan ditambahkan 400 L kloroform kemudian diinversi. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 1 menit pada suhu 4oC. Lapisan atas yang terbentuk ditambahkan 800 L etanol absolut dan diinkubasi pada suhu -20oC selama 1 jam. Sentrifugasi dilakukan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu 4oC. Endapan berupa pellet DNAditambahkan 500 L Etanol 70% dan disentrifugasi kembali. Pellet yang telah kering diresuspensi dengan 50 L molecular water dan ditambahkan RNAse serta diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit. Sentrifugasi 10000 rpm dilakukan selama 5 menit. Pellet kering ditambahkan 50 L molecular water. Suspensi tersebut disimpan pada suhu -20oC. Ketiga metode tersebut di atas dimodifikasi untuk mendapatkan DNA genom dengan kualitas terbaik. Modifikasi dilakukan dengan variasi penambahan etanol 76%, buffer pencuci (etanol 76% dan ammonium asetat 3M), Proteinase K, RNAse A, kalium asetat 5M, dan PVP. Selain itu, modifikasi juga dilakukan dengan variasi penambahan larutan pada tahap yang berbeda. (Utami, 2012)
2.3 PerbedaanIsolasi DNA KasardenganIsolasi DNA Buffer Ekstraksi Isolasi DNA dengan Buffer Isolasi DNA kasar Ekstraksi Memecahkandindingsel Memecahkandindingseldanmembra danmembranesellapisan neseldengandetergenmodifikasi pembungkusan CTAB danmercaptoetanol DNAdenganmenggunak andetergendangaramdap ur Tidakadapemanasanpad Proses a proses ini pemanasanpertamapertamabertujua nuntukmelarutkan CTAB danmercaptoetanol Tidakadapengendapank Kloroformdanisoamilalkohol

omponenpolisakarida

Tidakadapenambahan buffer TE

Diambillarutansupernata n yang bercampurdengankonta minanlainnya Ekstraksi DNA dengan kitchen preparation akanmenghasilkan DNA kasar yang menggumpaldanbelumm urni (masihbanyakzat lain yang terkandung)

(CIAA) berfungsiuntukmengekstrakdanmen gendapkankomponenpolisakarida di dalam buffer ekstraksi yang mengkontaminasilarutan DNA Buffer TE berfungsiuntukmelarutkan DNA yang dihasilkandanmenjaga DNA agar tidakmudahrusak Supernatant yang diambilkontaminannyasangatsedikit

Ekstraksi DNA dengan CTAB akanmenghasilkan pita DNA yang berukurantebaldandapatmemisahka n DNA daripolisakaridakarenaadanyaperbe daankarakteristikkelarutan (differentsial of solubility) (Yuwono, 2006)

2.4ManfaatIsolasi DNA Untuk mengetahui gen gen yang terdapat dalam sel tumbuhan tersebut. Gen gen yang terdapat pada sel tumbuhan tersebut dapat diaplikasikan dalam budidaya suatu tumbuhan melalui rekayasa genetika. Gen gen bagus yang terdapat dalam sel tumbuhan dapat dipertahankan sedangkan gen gen yang kurang menguntungkan dapat diminimalisasi dampaknya terhadap tumbuhan tersebut.(Abbas, 2012) Untukmendapatkan DNA murnisuatuseldalamjaringantubuhmakhlukhidup. (Yulia, 2012)

BAB III METODOLOGI 3.1 Alat, Bahan dan Fungsi Alat Mortar Pastle Erlenmeyer Cawan Saringan Spatula : Untuk melembutkan bahan praktikum : Untuk melembutkan bahan praktikum : Untuk tempat aquades : Untuk wadah garam dan detergen. : Untuk menyaring bahan yang di ekstraksi : Untuk mengaduk dan mengambil bahan praktikum Gunting : Untuk memotong bahan agar lebih kecil agar mempermudah dalam menghaluskannya. Timbangan : Untuk menimbang bahan praktikum Tabung Reaksi:Untuk meletakkan bahan yang sudah di haluskan dan untuk mereaksikan bahan. Gelas ukur : Untuk wadah pasta daun Pipet : Untuk mengambil etanol Kamera : Untuk mendokumentasi Bahan Mangga Aquades Garam Detergen

:Sebagai bahan praktikun yang akan diamati DNA nya. :Untuk melarutkan detergen dan garam :Untuk mengendapkan kotoran akibat rusaknya dinding sel. :Bu cream, bubuk, cair untuk merusak dinding sel dan meluruhkan DNA

3.2 Langkah kerja Menyiapkan alat dan bahan

mengupas mangga

Mengambil 5 gram untuk @perlakuan

Mengerus mangga dengan mortar dan pestle

Setelah mangga halus kemudian menambah garam, detergen ( Rinso cair, Rinso bubuk, dan Bu cream) masing-masing 2,5 gr

Menambahkan Aquades sebanyak 50 ml

Mengaduk dan membiarkannya selama 10 menit

Setelah menjadi extrak mangga, mengambilnya sebanyak 5 ml

Menambahkan etanol dingin sebanyak 6 ml

Mengamati supernatan setelah 10 menit

Hasil 3.3 Analisa Perlakuan Dalam praktikum Isolasi DNA kasar, pertama-tama yang harus dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan. Setelah semua siap mengupas mangga sebagai bahan pengamatan mengenai isolasi DNA, setelah itu memotong mangga kecilkecil dan mengerusnya dengan mortar dan pastle yang telah di siapkan sebelumnya, sehingga didapatkan pasta mangga. Kemudian mengulanginya sebanyak 3 kali. Memasukkan pasta mangga kedalam gelas ukur dimana terdapat 3 gelas ukur untuk masing-masing perlakuan. Menambahkan aquades sebanyak 50 ml, dan garam seberat 2,5 gram pada masing-masing perlakuan. Garam ini berfungsi untuk mengendapkan kotoran-kotorannya. Setiap langkah diatas dilakukan sebanyak 3 kali sehingga pembuatan pasta terdapat 3 tabung reaksi. Pada botol pertama menambahkan detergen bubuk dengan berat 2,5 gram, botol kedua menambahkan Bu crem sebanyak 2,5 gram, serta botol ke 3menambahkan dengan detergen cair sebanyak 2,5 gram. Pemberian detergen ini bertujuan untuk melisis sel. Kemudian mengaduknya hingga homogen lalu mendiamkan selama 10 agar mengendap. Setelah menjadi ekstrak mangga , mengambilnya sebanyak 5 ml dan menambahkan etanol dingin sebnyak 6 ml. Etanol ini berfungsi untuk menggumpalkan DNA. Mengamati supernatan setelah 10 dan mencatat serta mendokumentasikan hasil pengamatan.

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN 4.1 Hasil (Dokumentasi dan Keterangan)

Keterangan (dari kiri ke kanan) : Menggunakan detergen bubuk : paling keruh Menggunakan detergen cair : keruh, endapan bening Menggunakan bu cream : mengendap ke bawah 4.2 Pembahasan di banding dengan literature Gambar di atas adalah hasil dari praktikum isolasi DNA kasar dengan bahan mangga. Kita dapat melihat bahwa jenis deterjen memberikan pengaruh yang berbeda pada hasil isolasi DNA. Detergen yang menyebabkan warna paling keruh adalah detergen bubuk, detergen yang menyebabkan warna keruh dengan endapan bening adalah detergen cair, dan yang menghasilkan endapan ke bawah adalah detergen cream. Perlu diketahui juga bahwa detergen cair yang memiliki warna biru pekat juga mempengaruhi warna pada isolasi DNA. Jadi

detergen yang mempunyai daya rusak paling tinggi adalah detergen bubuk. Perbedaan detergen dalam mempengaruhi tingkat pemunculan DNA dalam isolasi DNA ini disebabkan karena kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen. Hal ini sesuai dengan literature yang menyebutkan bahwa Menurut Jamilah (2005: 95) diantara detergen bubuk, detergen menghasilkan warna yang paling baik, yaitu putih, detergen krim memberikan warna yang kurang baik karena menyebabkan warna filtrat mendekati warna detergen, sehingga isolasi DNA yang dihasilkan berwarna sama atau hampir sama dengan filtrat. Sementara pada isolat yang dihasilkan dari filtrat yang menggunakan detergen cair tidak menunjukkan adanya prespitasi DNA yang baik, kalaupun ada, konsentrasi dan viskositasnya sangat rendah. Pernyataan Jamilah tersebut dapat kita berikan pada isolasi DNA yang terjadi pada buah dengan konsentrasi air tinggi. Sedangkan untuk mengetahui fungsi detergen dalam isolasi DNA ini menurut (Jamilah, 2005: 11) dalam proses isolasi DNA, detergen berfungsi untuk melisiskan barier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler yang dapat merusak DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang biasa "memakan" DNA). Selain lisozim dan EDTA, bisa juga digunakan detergen seperti sodium dodesil sulfat (SDS) karena detergen ini bisa menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel, sehingga bisa merusak struktur membran sel. Selain itu, detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel engan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung

disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat.( Dollard 2005, dalam Jamilah, 2005: 11) menambahkan bahwa detergen ini kemudian membentuk kompleks dengam lipid dan protein dan menyebabkannya terpresipitasi ke dalam larutan. Padasaat penghancuran jaringan sampel pada awal proses isolasi DNA, terjadi pelepasan senyawa polifenol dan polisakarida. Senyawa polifenol yang teroksidasi akan mengadakan ikatan kovalen dengan DNA yang membentuk suatu senyawa kompleks berwarna kecokelatan, sedangkan polisakarida mengalami kompresipitasi dengan asam nukleat saat presipitasi dengan penambahan alkohol sehingga terbentuk suatu matriks seperti lem dalam jumlah berlebihan. Hal ini dapat menyebabkan DNA menjadi kental, sulit larut secara sempurna dan sulit di pipet meskipun telah dilarutkan dalam buffer TE. Akan tetapi jika ditinjau dari sudut pandang media, DNA yang baik adalah DNA yang serupa pintalan benang. Ditinjau dari faktor penambahan garam ke dalam larutan detergen pada proses isolasi DNA, garam digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekulmolekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994, dalam Jamilah, 2005: 21). Dari pernyataan tersebut, nampak bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA.Konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain: keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu ethanol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. menambahkan bahwa semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Kecepatan pembentukan DNA juga dipengaruhi oleh jenis detergen yang digunakan, dalam hal ini detergen bubuk memiliki kualitas paling baik dalam pembentukan DNA pada

ekstrak buah. Ini karena dalam detergen bubuk, kandungan senyawa kimia untuk melisiskan sel terdapat dalam konsentrasi yang lebih tinggi daripada detergen jenis lain (Jamilah, 2005).

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan Dari pengamatan pada praktikum isolasi DNA kasar dengan bahan mangga dapat diketahui bahwa jenis deterjen berpengaruh pada hasil isolasi DNA dan jenis deterjen tertentu memberikan pengaruh yang berbeda-beda. Detergen yang menyebabkan warna paling keruh adalah detergen bubuk, detergen yang menyebabkan warna keruh dengan endapan bening adalah detergen cair, dan yang menghasilkan endapan ke bawah adalah detergen cream. Jadi detergen yang mempunyai daya rusak paling tinggi adalah detergen bubuk. Perbedaan detergen dalam mempengaruhi tingkat pemunculan DNA dalm isolasi DNA ini disebabkan karena kandungan detergen tersebut berbeda, misalnya lauryl sulfat yang dapat berfungsi sama dengan dodesil sulfat dan disodium EDTA, serta kandungan zat pewarna dan zat aktif pemutih yang biasanya ada dalam detergen. Selain itu, kemampuan masing-masing detergen untuk melisis sel berbeda-beda sehingga menghasilkan yang berbedabeda pula.Konsentrasi DNA yang terpresipitasi tergantung dari beberapa hal, antara lain: keenceran sumber DNA yang digunakan dan suhu ethanol. Semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Sementara semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. menambahkan bahwa semakin encer filtrat, maka DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. 5.2 Saran Untuk praktikum Praktikum bioteknologi sudah bagus dan terstruktur dalam penyampaian materi. Tetapi mohon peralatan di maksimalkan. Untuk asisten Ok dah pokoknya mas Putu. Bravo Bali!!! hahaha

DAFTAR PUSTAKA Abbas, usnun Hamidah. 2012. Macam Metode Isolasi DNA (online).http://dc317.4shared.com/doc/e70nZ7SO/preview.htm l. Diakses pada 2 Desember 2012. Hatta, M. 2002. Teknik Isolasi dan Pengukuran DNA. Seminar Teknik Isolasi DNA, Makassar, Universitas Hasanuddin. Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang. Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor Sabirose, Bernadhete Gaudia. 2012. Tahapan Isolasi DNA (Online). http://www.scribd.com/doc/86207052/Isolasi-Dna.diakses tanggal 3 Desember 2012. Utami, Annisa; Riani Meryalita; Nur Aeny Prihatin; Laksmi Ambarsari; Popi Asri Kurniatin; Waras Nurcholis.2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (Cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa. Surabaya Yulia, Floweriza. Manfaat dari Isolasi DNA http://flowerizayulia.blogspot.com/2012/01/isolasidna.html.diakses tanggal 3 Desember 2012. (online).

Yuwono, T.2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta : Gajahmada University Press.