LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

ISOLASI DNA

Dosen Pembimbing :
dr.Dewi Kartika M.Sc

Disusun oleh :
Fitria Jane Anggiluli
2013010077

LABORATORIUM BIOKIMIA
FAKULTAS KEDOKTERAN
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO
2020
A. Jurnal :
Ekstraksi DNA dari Daging Sapi Aceh dan Sapi Madura untuk Analisis
dengan Metode Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) DNA
Extraction from Raw Meat for Analysis with the Loop-Mediated Isothermal
Amplification (LAMP) Method.
B. METODE
Sampel darah di dalam alkohol absolut dicuci dengan air destilata steril
sebelum dilakukan ekstraksi. Kemudian sampel darah diendapkan dengan
sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Sampel darah yang
diambil untuk ekstraksi DNA adalah sebanyak 100 μl. Pada proses lisis endapan
sampel darah 100 μl dilarutkan dalam larutan STE (Salt Tris EDTA) hingga 1
ml. Proteinase K digunakan sebanyak 10 µl dan diinkubasi pada suhu 550C
selama 1 jam. Selanjutnya ditambahkan SDS (Sodium Dodecyl Sulfat).
Purifikasi DNA digunakan Phenol 1 ml dan CIAA (Chloroform Isoamil
Alkohol) 1 ml. Perbandingan volume Phenol : Chloroform : Isomilalkohol
adalah 25:24:1. Kemudian ditambahkan larutan NaCl 5 M sebanyak 100 µl dan
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Proses presipitasi
menggunakan alkohol absolut 2 x volum awal dan NaCl 5 M 1/10 volume awal.
Pada tahapan presipitasi DNA diendapkan dengan sentrifugasi 13000 rpm
selama 10 menit.
Metode ekstraksi phenol-chloroform merupakan metode ektraksi fase
cair (Hutami et al. 2017). Metode ekstraksi phenol-chloroform secara umum
terdiri dari tiga tahap yakni proses lisis sel, pemisahan DNA dan pemurnian
DNA. Proses lisis sel dilakukan secara kimiawi dengan penambahan detergen
sodium dodecyl sulfate (SDS) dan enzimatik dengan penambahan proteinase-K
pada tahap awal ekstraksi. Penambahan SDS berfungsi untuk melarutkan lipid
pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel serta mengikat
protein dan polisakarida pada membran sel sehingga membran sel terbuka
(Surzycki 2000; Demeke et al., 2009). Selain berperan dalam pemecahan sel,
penambahan SDS juga berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease
yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Ebeling et al., 1974). Sementara itu
enzim proteinase-K berfungsi untuk memutus gugus karboksil asam amino pada
ikatan peptida yang menyusun lapisan peptidoglikan dinding sel (Surzycki
2000). Proses lisis dilakukan dalam larutan salt tris EDTA (STE). Tris berfungsi
sebagai buffer yang mencegah kerusakan DNA dengan mempertahankan pH
dalam keadaan normal, yakni pada pH 8 (Montgomery et al. 1990). Sementara
EDTA berfungsi agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam bermuatan
positif seperti Ca2+ dan Mg2+ pada membran sel yang menyebabkan membran
sel mudah terurai (Surzycki 2000)
Tahap pemisahan DNA dilakukan dengan penambahan phenol-
chloroform dan chloroform isoamyl alcohol (CIA). Penambahan fenol
menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi
sehingga selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp
2008). Larutan fenol dan CIA dapat mengikat protein, sebagian kecil RNA, lipid
dan polisakarida (Sambrook et al. 1989; Muladno 2010; Utami 2012). Menurut
Bettelheim dan Landdesberg (2007), setelah disentrifugasi, campuran akan
terpisah menjadi dua fase yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase
aqueous (air) berada pada lapisan atas. DNA dan RNA akan berada pada fase
aqueous sementara makromolekul protein, lipid dan polisakarida akan berada
pada fase organik.
Proses ekstraksi dilanjutkan dengan penambahan etanol absolut dan
NaCl 5 M. Penambahan etanol dan NaCl menyebabkan penurunan kelarutan
asam nukleat dalam air sehingga DNA mengalami persipitasi membentuk
endapan DNA pada bagian bawah tabung (Surzycki 2000). Setelah proses
presipitasi, dilakukan pencucian endapan DNA menggunakan etanol. Residu
etanol selanjutnya dihilangkan dengan cara evaporasi karena etanol mudah
menguap
Prinsip kit ekstraksi yang digunakan ialah penggunaan silikon dioksida
dalam sebuah spin column yang mampu mengabsorpsi DNA. Sama halnya
dengan proses ekstraksi DNA menggunakan phenolchloroform, proses ekstraksi
DNA menggunakan kit dengan kolom silika juga secara umum tediri dari tiga
tahap yaitu lisis sel, pemisahan DNA dan pemurnian DNA. Metode ini termasuk
dalam metode ekstraksi fase solid (Hutami et al. 2017).
 Tahap lisis sel dalam metode ekstrasi dengan kit estraksi dilakukan
dengan secara kimiawi dan enzimatik menggunakan lysis buffer, proteinase-K,
RNAse, dan dithiothreitol (DTT). DTT berfungsi untuk merduksi ikatan
disulfida yang menyusun membran sel, karena keberadaan ikatan disulfida
menyebabkan kinerja lysis buffer tidak efektif (Butler 2001). Tahap pemisahan
DNA dilakukan berdasarkan adsorbsi DNA pada pada partikal silika sementara
pertikel makromolekul lainnya mengendap di dasar tabung. Absorpsi DNA
dapat terjadi karena tingginya afinitas muatan negatif rantai DNA terhadap
partikel silika yang bermuatan positif (Boom et al. 1990). Setelah proses
pemisahan DNA, dilakukan pemurnian DNA menggunakan etanol.
C. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN
- Kelebihan
A.) Metode ekstraksiPhenol-Chloroform memberikan keunggulan terhadap harga
yang lebih murah, lebih sensitif dalam isolasi DNA, dan menghasilkan pita DNA
yang jelas
- Kekurangan
A. Phenol, Chloroform, dan Isoamil alkohol merupakan larutan yang
mudahmengalami oksidasi.
B. Selain itu,Phenolmerupakan senyawa yang bersifat toksik.
C. Waktu yang dibutuhkan dalam ekstrasi DNA lebih lama.
D. PERBANDINGAN DENGAN KIT WIZARD PROGMEGA
` Perbandingan metode ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi Phenol-
Chloroform dan metode ekstraksi KIT setelah diamplifikasi menunjukkan pita DNA
yang jelas. Amplifikasi menggunakan gen leptin menunjukkan ukuran pita DNA
sebesar 234 bp. Visualisasi DNA pada metode Phenol- Chloroform menunjukkan pita
DNA tunggal, tidak terlihat kontaminan, dan ukuran DNA lebih tipis. Hasil ini
menunjukkan metode Phenol-Chloroform lebih cocok digunakan untuk pemetaan
genetik, teknologi marker, dan DNA sequencing . Metode KIT Extraction
memperlihatkan sedikit kontaminan dan semua sampel pada KIT Extraction
menunjukkan ukuran pita DNA yang tebal.
 Reagent yang digunakan pada setiap tahapan metode ekstraksi Phenol-
Chloroform dan KIT Extraction menunjukkan perbedaan. Metode ekstraksi Phenol-
Chloroform secara umum terdiri atas tiga tahap, yaitu proses lisis sel, purifikasi, dan
presipitasi. Proses lisis sel menggunakan SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) untuk mengikat
protein dan lemak pada membran sel sehingga membran sel terbuka dan semua isi sel
keluar . Selain itu proses lisis sel menggunakan enzim Proteinase K berperan untuk
menghancurkan protein . Pada proses lisis endapan sampel dilarutkan dalam larutan
STE (Salt Tris EDTA). STE berfungsi sebagai buffer untuk mencegah kerusakan DNA
dengan mempertahankan pH dalam keadaan normal, yaitu pH=8. Tahap purifikasi
bertujuan untuk memurnikan DNA dari makromolekul sel lainnya setelah sel
dihancurkan. Metode ekstraksi Phenol-Chloroform menggunakan larutan Fenol dan
CIAA (Chloroform Isoamil Alkohol) untuk mengikat protein, lipid, dan karbohidrat .
Selain itu pada tahap purifikasi digunakan larutan NaCl jenuh untuk memekatkan DNA.
Pemisahan DNA dan makromolekul sel lainnya terpisah setelah disentrifugasi.
Makromolekul protein dan polisakarida yang diikat oleh Phenol dan dan CIAA
(Chloroform Isoamil Alkohol) mengendap di dasar tabung, sedangkan DNA dan air
berada di lapisan atas . DNA yang diperoleh masih terlarut di dalam air sehingga dalam
metode ekstraksi ini digunakan alkohol absolut pada proses presipitasi. Tahap
Pencucian etanol dan sisa garam dari endapan DNA dilakukan dengan sentrifugasi dan
vakum untuk memurnikan DNA. Etanol diuapkan dalam ruang vakum sehingga
diperoleh endapan pelet DNA murni. Pelet DNA berupa endapan kering sehingga pada
metode ini menggunakan aquadest untuk pengenceran DNA. Pada KIT Extraction
bahan yang digunakan telah dirancang untuk memudahkan dalam melakukan isolasi
DNA. Selain itu, fasilitas pengikatan DNA dirancang dalam suatu tabung yang memiliki
matriks sebagai tempat pengikatan DNA. Matriks terlindungi di dalam tabung sehingga
tidak mudah rusak.
Ekstraksi DNA menggunakan metode KIT Extraction lebih singkat jika
dibandingkan dengan metode Phenol-Chloroform. Total waktu yang dibutuhkan pada
metode KIT Extraction sekitar 35 menit, sedangkan metode ekstraksi DNA Phenol-
Chloroform membutuhkan waktu sekitar 2 jam 47 menit . Metode Phenol-Chloroform
merupakan metode yang lebih sensitif jika dibandingkan dengan KIT Extraction
sehingga membutuhkan ketelitian dalam melakukan ekstraksi DNA atau dalam
mempersiapkan larutan yang dibutuhkan . Larutan Phenol dan Chloroform-Isoamil
Alkohol perlu dipersiapkan sebelum ekstraksi DNA dilakukan. Phenol, Chloroform, dan
Isoamil alkohol merupakan larutan yang mudah mengalami oksidasi. Selain itu, Phenol
merupakan senyawa yang bersifat toksik. Perbandingan biaya yang dikeluarkan pada
saat melakukan ekstraksi DNA metode Phenol- Chloroform memerlukan biaya yang
lebih murah jika dibandingkan dengan KIT Extraction.

E. METODE KIT
a. Alat :
1. Spuit injeksi 5 cc
2. Kapas alcohol
3. Torniquet
4. Tabung EDTA
5. Centrifuge
6. Micropipette 100-1000
7. Micropipette 10 – 100
8. Blue tip
9. Yellow tip
10. Incubator
11. Vortex
12. Microtube
b. Bahan :
1. Cell Lisis Solution
2. Nuclei Lisis Solution
3. Protein Precipitation Solution
4. Isopropanolol
5. DNA Rehydration Solution
6. Ethanol 70%

c. CARA KERJA :
Metode Ekstraksi Phenol-Chloroform
1. Sampel darah di dalam alkohol absolut dicuci dengan air destilata steril
sebelumdilakukan ekstraksi.
2. Kemudian sampel darahdiendapkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan5000 rpm selama 5 menit.
3. Sampel darah yangdiambil untuk ekstraksi DNA adalah sebanyak100
μl.Pada proses lisis endapan sampel darah100 μl dilarutkan dalam larutan
STE (Salt TrisEDTA) hingga 1 ml.
4. Proteinase K digunakansebanyak 10 μ l dan diinkubasi pada suhu
550Cselama 1 jam.
5. Selanjutnya ditambahkan SDS(Sodium Dodecyl Sulfat).
6. Purifikasi DNA digunakan Phenol1 ml dan CIAA (ChloroformIsoamil
Alkohol) 1 ml. Perbandingan volumePhenol : Chloroform : Isomilalkohol
adalah25:24:1.
7. Kemudian ditambahkan larutan NaCl 5M sebanyak 100 μ l dan
disentrifugasi dengankecepatan 13000 rpm selama 5 menit.
8. Proses presipitasi menggunakan alkohol absolut 2 xvolum awal dan NaCl
5 M 1/10 volume awal.
9. Pada tahapan presipitasi DNA diendapkandengan sentrifugasi 13000 rpm
selama 10 menit
 DAFTAR PUSTAKA

Buchanan R. W, Julie Kreyenbuhl, Julie M. Zito, and Anthony Lehman. 2002. The
Schizophrenia PORT Pharmacological Treatment Recommendations:
Conformance and Implications for Symptoms and Functional Outcome.
Schizophrenia Bulletin, Vol. 28, No. 1, 200.
Montgomery GW, Sise JA. 1990. Extraction DNA from sheep white blood cell. New
Zealand Journal of Agricultural Research. 33: 437-441
Kamilah.2017.PERBANDINGAN METODE EKSTRAKSI DNA PHENOL-CHLOROFORM
DAN KIT EXTRACTION PADA SAPI ACEH DAN SAPI MADUR.Aceh:UIN
Pereira, F, J. Carneiro, dan A. Amorim. 2008. Identification of Species with DNA-Based
Technology: Current Progress and Challenges. Recent Patents on DNA & Gene
Sequences, 2, 187-200.
Rosy Hutami, Hanifah Bisyri, Sukarno, Henny Nuraini, Raafqi Ranasasmita.2019.
Ekstraksi DNA dari Daging Segar untuk Analisis dengan Metode Loop-Mediated
Isothermal Amplification (LAMP).Bogor
Sari, EM, H. Jianlin, R.R. Noor, C. Sumantri, dan E.T. Margawati. 2016. Phylogenetic
analysis of aceh cattle breed of Indonesia through mitochondrial D-loop region.
Journal of genetic engineering and biotechnology 14:227-231.