Anda di halaman 1dari 17

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Dalam sel makhluk hidup terdapat dua jenis asam
nukleat, yaitu DNA dan RNA. DNA merupakan materi
genetik yang mengkode semua informasi yang
dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organism. DNA ada dua macam, yaitu DNA kromosomal
dan DNA ekstrakromosomal.DNA ekstrakromosomal
seperti DNA mitokondria, DNA kloroplas dan DNA
plasmid.
Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan
untuk memperoleh DNA murni, yaitu DNA yang tidak
terkontaminasi oleh protein, RNA atau sel dari suatu
jaringan. Pada proses isolasi DNA ini, sel eukariotik
harus dihancurkan terlebih dahulu melalui cara mekanik
dan enzimatis. Hal ini disebabkan membran sel dari
membrane inti sebagian besar tersusun atas lipida.
1.2 Tujuan
Untuk mendapatkan DNA murni dengan
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak,
dan karbohidrat.
1.3 Manfaat
Agar mahasiswa dapat mengetahui tahapan isolasi
DNA, metode yang digunakan serta dapat mengetahui
bentuk dari DNA.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA


2.1 Pengertian Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan mengeluarkan materi DNA
dari inti yang sebelumnya dinding sel harus dipecahkan
terlebih dahulu dengan cara mekanik ataupun enzimatik
(Kartini, 2012).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA.
Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi.
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).
DNA isolation is the use of DNA for analysis or
manipulation usually requires that it is isolated and
purified to a certain extend (Wilson, 2010).
Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisis
atau dimanupilasi sehingga harus diisolasi terlebih
dahulu agar kandungannya murni.
2.2 Macam Metode Isolasi DNA
2.2.1 Metode dengan Menggunakan Kit Ekstraksi
DNA (Wizard Genomic DNA Purufucation Promega)
Metode ini merupakan metode yang dikeluarkan
oleh Promega Corporation dan telah teruji hasilnya,
namun disisi lain biaya yang dibutuhkan cukup
besar (Mulyani, 2013).
2.2.2 Metode CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl
Amonium Bromide) dengan Phenol
Metode ini memiliki waktu pengerjaan cukup
singkat dimana pada proses presipitasinya
digunakan penambahan P : C : I untuk memisahkan
DNA dengan materi ikutan lainnya (Mulyani, 2013).

2.2.3 Metode Modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl


Trimethyl Amonium Bromide)
Metode ini memaksimalkan presipitasi DNA
dengan menggunakan C : IAA secara berulang
yakni dua kali untuk mendapatkan DNA yang bebas
dari pengotor. Nilai konsentrasi DNA yang didapat
relatif tinggi namun didalam pengerjaannya
dibutuhkan waktu yang relatif lebih lama (Mulyani,
2013).
2.2.4 Metode Ekstraksi DNA dengan Thermal Lysis
Metode ini memiliki waktu pengerjaan yang
sangat singkat. Namun dalam pengerjaannya tidak
melibatkan proses presipitasi dan pencucian DNA
melainkan hanya melakukan proses ekstraksi saja
(Mulyani, 2013).
2.2.5 Teknik Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD)
Teknik pengujian polimofisme DNA berdasarkan
pada amplifikasi dari segmen-segmen DNA acak
yang menggunkan primer tunggal yang sekuen
nukleotidanya ditentukan secara acak.Primer
tunggal ini biasanya berukuran 10 basa.PCR
dilakukan pada suhu annealing yang rendah yang
memungkinkan primer menempel pada beberapa
lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer
adalah terdiri atas 18-28 susunana basa dengan
presentase G + C 50-6-% (Subandiyah, 2006).

2.2.6 Slating Out


Teknik ini mneggunakan garam konsentrasi tinggi
(NaCl 6M), untuk mendenaturasi protein
menggunakan proteinasi K untuk denaturasi protein
(Barnum, 2005).
2.2.7 Guanidine Isothiocyanate
Metode ini lenih cepat dibandingkan dua metode
sebelumnya. Thyocyanate bersifat toksik yang
berfungsi dalam melisis dinding sel. Juga
memerlukan chloroform untuk denaturasi protein
(Barnum, 2005).
2.2.8 Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantara
garam/buffer tertentu. Metode ini berlangsung cepat,
tetapi recovery DNA kurang (Barnum, 2005).
2.2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Metode ini merupakan suatu teknik perbanyakan
(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada
daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida. Primer yang dgunakan sebagai
pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA
untai tunggal yang urutannya komplemen dengan
DNA templatenya. Proses tersebut mirip dengan
proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat
semi konservatif (Giri, 2004).
2.3 Tahap Isolasi DNA
2.3.1 Isolasi Jaringan
Tahap pertama yang dilakukan adalah
mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

2.3.2 Pelisisan Dinding dan Membran Sel


Tahap kedua yaitu melisiskan dinding dan
membrane sel dengan cara penggerusan
(homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih
dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan
pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus
dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada
didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini
bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak
mengandung DNA agar sel yang mengandung inti
sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponenkomponen sel lainnya yang tidak berfungsi.
2.3.3 Pengekstrasian Dalam Larutan
Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang
dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan.
Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.
2.3.4 Purifikasi
Tahap purifikasi ini bertujuan untuk
membersihkan hasil ekstraksi dari zat-zat lainnya.
Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse
dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65oC.
Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja
enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperature.
Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan
kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi
secara utuh.
2.3.5 Presipitasi
Presipitasi merupakan tahap terakhir. Tahap ini
bertujuan untuk mengendapkan protein histon
sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung
(coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang
menyebabkan DNA dapat terlihat. Tahap presipitasi
dilakukan dengan cara meneteskan larutan
presipitasi protein dan kemudian divortex yang

bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan


presipitasi protein terdiri atas ammonium asetat
yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan
terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih
rendah, sehingga menyebabkan protein
mengendap. Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan
kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi
adalah memisahkan substansi berdasarkan berat
jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan
berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih
ringan akan terletak di atas (Fauziah, 2010).
2.4 Manfaat Isolasi DNA
2.4.1 Dalam program pemuliaan tanaman,
diperlukan identifikasi baik karakter morfologi
maupun molekuler untuk menguji keragaman
genotip klon-klon yang akan dipilih untuk tetua
persilangan.
2.4.2 Teknik biologi molekuler telah memberikan
peluang untuk mengembangkan dan
mengindentifikasi peta genetik dari suatu kultivar
tanaman. Pendekatan genetika molekuler dengan
menggunakan penanda DNA telah berhasil
membentuk penanda molekuler yang mampu dalam
mendetekdi gen dan sifat-sifat tertentu, evaluasi
keragaman dan evolusi pada tingkat genetik.
Beberapa teknik penanda DNA tersebut adalah
Restriction Fragment Length Polymorphism dan
Random Amplified Polymorphic DNA (Agus, 2010).
BAB III METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan


3.1.1 Alat
1. Timbangan
2. Tubes 1,5 dan 2 ml
3. Tip 1 ml
4. Mikro pipet
5. Vortex
6. Oven
7. Centrifuge

8. Frezer

: untuk menimbang bahan


: untuk tempat larutan
: menampung larutan
pada micro pipet
: untuk mengambil larutan
: untuk menghomogenkan
larutan
: untuk menginkubasi pada
suhu 65oC
: untuk memisahkan DNA
dari zat lain dalam sel
berdasarkan berat
molekulnya
: untuk menggumpalkan
supernatan

3.1.2 Bahan
1) Daun jagung

: sebagai bahan isolasi


DNA
2) Daun kacang tanah : sebagai bahan isolasi
DNA
3) PVP (polivinil pirolidon): mencegah terjadinya
browning dan kontaminasi
fenol
4) Nitrogen Cair
: untuk merusak dinding
sel
5) Chisam
: menghilangkan etanol
dan flafanoid
6) Isopropanol dingin
: menggumpalkan DNA
7) Buffer pencuci
: untuk menghindari
kontaminasi
8) Buffer TE 20 ml
: melarutkan DNA
9) Buffer ekstraksi
: melindungi DNA ketika
terjadi reaksi kimia
10) Mercaptoethanol
: mencegah terjadinya

11) Karbon

browning dan kontaminasi


polisakarida
: untuk menghindari
kerusakan saat
penggerusan

3.2 Langkah Kerja

MMM
SeV
nemo
nt
caisx
e
maklt
kmb
anb
apnhe
una
krg
tt
de

ee
r y

u p
aa

el

b
a

n1
bm

,
a

5
l

MMM eee m
MmmSSM ee ii eennn m
MMt r i eef un n
ddmb aao b hhl a k
tags r meui f pbu e
kgk- b aa a ann ml i k
ugk aee r i n
aa h t ki a
ng
nDp eN l Al e

buang
rn a ta n
g
t

m e n it

a n g in
s e la m a

Dokumentasi

3.3 Analisis Perlakuan


Pertama menyiapkan alat dan bahan yang
dibutuhkan dalam percobaan. Mencampur buffer
ekstraksi 1 ml, karbon dan mercaptoethanol 4 l. buffer
ekstraksi berfungsi untuk melindungi DNA ketika terjadi
reaksi kimia, karbon berfungsi untuk menghindari
kerusakan saat penggerusan, sedangkan
mercaptoethanol berfungsi untuk mencegah terjadinya
browning dan kontaminasi polisakarida, kemudian
memasukkan campuran tersebut ke tube 1,5 ml. Setelah
itu menimbang daun jagung dan daun kacang tanah
masing-masing 0,1 gram tanpa tulang daun,
memasukkan ke mortar lalu menambahkan nitrogen cair
dan PVP. Daun segera digerus sampai halus dan jangan
mencair. Penambahan nitrogen berfungsi untuk merusak
dinding sel agar mudah digerus, sedangkan PVP
berfungsi untuk mencegah terjadinya browning dan
kontaminasi fenol. Setelah itu memasukkan ke dalam
tube 1,5 ml tadi, dan vortex larutan agar homogen. Lalu
diinkubasi dalam oven dengan suhu 65oC selama 10
menit. Setelah dioven, mendinginkan larutan sebentar.
Langkah berikutnya, larutan di sentrifuge dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Centrifuge
berfungi untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam sel
berdasarkan berat molekulnya. Setelah itu, mengambil
supernatan dan memindahkannya ke tube (2ml) baru.
Supernatan adalah larutan yang berada diatas dan
berwarna lebih bening. Lalu menambahkan 500l

chisam dan vortex lagi agar larutan homogen. Chisam:


berfungsi untuk menghilangkan etanol dan flafanoid.
Setelah homogen, larutan di sentrifuge lagi dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya,
memindahkan supernatan ke tube (2ml) baru,
menambahkan chisam lagi dan vortex lagi, lalu
sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5
menit. Berikutnya memindahkan supernatan ke tube
(2ml) baru dan menambahkan 300 l isopropanol yang
berfungsi untuk menggumpalkan DNA. Membolakbalikkan tube secara perlahan, lalu diinkubasi dalam
freezer selama 15 menit. Sentrifuge kembali dengan
kecepatan 8000 rpm selama 5 menit. Langkah
berikutnya adalah membuang supernatan, lalu
menambahkan buffer pencuci 500 l pada pellet dalam
tube dan vortex kembali. Buffer pencuci ditambahkan
untuk menghindari kontaminasi. Kemudian sentrifuge
dengan kecepatan 9000 rpm selama 5 menit. Lalu
mengamati DNA yang muncul. DNA akan tampak seperti
titik-titik putih dalam larutan.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN


4.1 Hasil
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan
didapatkan hasil bahwa DNA yang berasal dari daun
tanaman jagung dan kacang tanah tidak begitu terlihat
dengan jelas karena ukuran DNA yang hanya seperti titik
putih. Pada daun tanaman jagung setelah tube dibolakbalik terlihat DNA dengan titik putih yang lebih besar, itu
dikarenakan DNA telah mengalami goncangan atau
telah terkontaminasi. Sedangkan DNA pada daun
tanaman kacang tanah hanya terlihat titik kecil.
4.2 Pembahasan
DNA yang berasal dari daun tanaman jagung dan
kacang tanah tidak terlihat begitu jelas diduga karena
kurang lama saat di inkubasi. Menurut Langga (2012)
mengatakan bahwa perlakuan pada konsentrasi DNA
ada tiga yaitu perlakuan suhu, lama inkubasi dan
interaksi antara suhu dengan lama inkubasi, dari ketiga
faktor tersebut, suhu berpengaruh nyata terhadap
konsentrasi DNA begitu juga dengan lama inkubasi,
sedangkan interaksi antara lama suhu dan inkubasi tidak
berpengaruh nyata terhadap konsentrasi.

BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa
isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk
memperoleh DNA murni dari tanaman jagung dan
kacang tanah, diperoleh hasil DNA berupa titik kecil
berwarna putih.
5.2 Kritik dan Saran
5.2.1 Kritik dan Saran Untuk Praktikum Tahun
Depan
Praktikum isolasi DNA membutuhkan waktu yang
lama, sebaiknya dilakukan pada hari khusus untuk
praktikum ini, agar dalam mendapatkan DNA murni
dapat terlihat dengan jelas
5.2.2 Kritik dan Saran Untuk Asisten
Mbak Apin sering bingung sendiri, kadang heboh
sendiri, praktikannya jadi ikut bingung.Sebaiknya
lebih dipersiapkan lagi materi untuk praktikum
maupun asistensi supaya tidak bingung. Terimakasi
mbak apin sudah menemani J1 dan J2 selama satu
semester ini,semoga UAP kelas J lancar aamiin.

DAFTAR PUSTAKA
Agus dan Maftuchah. 2010. Pengembangan Metode
Isolasi DNA Genom Pada Tanaman Jarak Pagar
(Jatropha curcas). Malang: UMM.
Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction
2nd Edition. USA: Thomson Brooks/Cole.
Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA.
Giri, Rahman EA. 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada
Organisme Bakteri. Bandung:KPP Bioteknologi
Bandung.
Kartini, Rizki Ayu. 2012. Karakterisasi Molekuler Padi
Transgenik dengan Bebrapa Metode Isolasi DNA.
Bogor: IPB Repository.
Langga, Indah F., Restu dan Tutik Kuswinanti. 2012.
Optimalisasi Suhu Dan Lama Inkubasi Dalam
Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus
Reins) Serta Analisis Keragaman Genetik
Dengan Teknik RAPD-PCR. Vol.12 No.3:265276. Program Studi Sistem-sistem Pertanian,
Program Pascasarjana, Universitas Hasanuddin.
Mader, S. S. 1993. Biology. Lowa: Wm.C Brown
Publishers.
Mulyani, Yuniar, dkk. 2013. Perbandingan Beberapa
Metode Isolasi DNA untuk Deteksi DIni Koi
Herpes Virus (KHV) pada Ikan Mas (Cyprinus
carpio L.). FPIK Universitas Padjajaran Jatinagor.

Subandiyah, S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk


Deteksi atau Identifikasi Patogen
Tumbuhan.Beberapa Metode Ekstraksi DNA.
Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan
Aplikasi PCR.Malang: Hlm. 43-50.
Wilson, Keith and John Wlker. 2010. Principles and
Techniques of Biochemistry and Molekuler
Biology. New York: Cambrige University Press.