Praktikum Fisiologi dan Perkembangan Tumbuhan BA-2101

Kultur Jaringan Tumbuhan

Meidina Rizkita | 11416032

Asisten
Nadya Nurul Amalina | 11415016

Jalan Let. Jen. Purn. Dr. (HC) Mashudi No. 1 / Jalan Raya Jatinangor KM 20.75, Desa
Sayang, Kecamatan Jatinangor, Kabupaten Sumedang, Jawa Barat - Indonesia, 45363.

ABSTRAK
Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan tubuhan in vitro yang
mengandalkan sifat totipotensi jaringan, sel, atau organ suatu tumbuhan untuk
ditanamkan ke media buatan yang sudah diberi nutrisi berisi makronutrien, mikronutrien,
dan zat-zat lain yang dibutuhkan oleh tumbuhan sehingga dapat menjadi tanaman yang
utuh. Media yang dipakai untuk menanam kultur jaringan juga ditambahkan hormon
penumtuh tanaman yang berupa NAA dan BA. BA berperan sebagai perangsang
pembelahan sel, sementara NAA berfungsi untuk menentukan arah diferensiasi sel.
Komposisi kedua hormon ini sangat berpengaruh pada arah pertumbuhan kultur jaringan.
Praktikum ini menunjukkan bahwa perbandingan hormon yang menunjukkan
pertumbuhan tanaman yang terbaik adalah perbandingan dengan konsentrasi masing-
masing 0M NAA dan 0M BA.

Kata Kunci: Kultur jaringan, hormon, pertumbuhan.

PENDAHULUAN
Tumbuhan adalah bagian paling
penting yang berperan dalam
memproduksi produk-produk alami
dalam bidang pangan, bangunan,
pakaian, dan juga kesehatan. Namun,
belakangan ini kesulitan untuk
mendapatkan sumber yang penting ini
semakin meningkat akibat gangguan
manusia, eksploitasi berlebihan, dan
kesulitan ekonomi ataupun teknis dalam
membudidayakan tumbuhan. Maka
kultur jaringan diharapkan dapat
menjadi solusi untuk permasalahan-
permasalahan tadi. (Barz, dkk, 1976)
Kultur jaringan merupakan salah
satu cara memperbanyak tanaman.
Caranya adalah dengan mengisolasi sel
atau jaringan tanaman yang akan disebut
eksplan, lalu distimulasi dengan
lingkungan utuh yang sesuai agar
menjadi tanaman secara utuh (Gunawan,
1988) Prinsip kultur jaringan adalah
kemampuan totipotensi sel. Teori
tersebut menyatakan bahwa sel
merupakan unit biologis terkecul yang
dapat melakkan metabolisme,
reproduksi, dan tumbuh. (Karjadi dan
Buchory, 2008)
Dalam kultur jaringan zat
pengatur pertumbuhan mempunyai
peran yang sangat penting. Sitokinin dan
auksin adalah dua zat pengatur
pertumbuhan yang penting bagi
tanaman. Sitokinin terbuat dari BA
(benzyl adenine), kinetin (furfural amino
puril), 2-1p(dimethyl allyl amino purin),
dan zeatin. Sementara auksin terbuat
dari IAA (indole acetic acid), NAA
(naphthalene acetic acid), IBA (Indole
butyric acid), 2,4-D(4-amino-3,5,6-
tricloropicolinic). (Lestari, 2011). Tipe
dan konsentrasi dari zat pengatur
pertumbuhan berbeda tergantung pada
genetic dan kondisi fisiologis dari
eksplan (Herawan dan ismail, 2009)
Pada tanaman tembakau, keseimbangan
antara auksin dan sitokinin dapat
mengatur pertumbuhan tunas dan kalus
pada kultur in vitro. Auksin dan
sitokinin berperan dalam pertumbuhan
tunas. Oleh karena itu untuk
mendapatkan hasil kultur jaringan
tembakau yang optimal diperlukan
kombinasi komposisi ZPT berupa
hormon auksin dan sitokinin yang tepat
Medium Murashige dan Skoog
(Medium MS) adalah medium standar
yang paling sering digunakan dalam
kultur jaringan dari jaringan atau kalus.
Medium ini pada mulanya dikembang
kan oleh Toshio Murashige dan Folke
K. Skoog untuk penelitian kandungan
mineral pada kultur tanaman tembakau.
Media MS mengandung 40 mM N
dalam bentuk NO3 dan 29 mM dalam
bentuk NH4+. Konsentrasi ini lebih besar
dibandingkan dengan media-media
lainnya. Walaupun unsur-unsur makro
dalam media MS dibuat untuk kultur
kalus tembakau, namun komposisinya
mampu mendukung kultur jaringan
tanaman lain. (Trigiano dan Gray, 2010)
Perbanyakan tanaman dengan
menggunakan metode kultur jaringan
perlu dipelajari oleh mahasiswa
rekayasa pertanian, karena metode ini
merupakan metode yang mudah dan
cepat dilakukan sehingga lebih efektif
dan efisien. Perbanyakan tumbuhan
secara cepat dibutuhkan untuk penelitian
dalam bidang rekayasa pertanian yang
melakukan banyak variasi perlakuan
pada sampel yang banyak juga.
METODOLOGI
Alat-alat yang digunakan dalam
percobaan ini adalah Autoklaf, batang
pengaduk, botol kultur, cawan petri,
clean bench, erlenmeyer, gelas kimia,
gelas ukur, hotplate, kertas saring,
laminar air flow cabinet lampu spirtus,
lampu TLD, pH meter, pinset, pipet
ukur, rak kultur, dan scalpel+blade .
Bahan-bahan yang digunakan
dalam percobaan ini adalah agar-agar,
alkohol, alumunium foil, aquades, daun
ginseng jawa (Talinum paniculatum),
daun tembakau (Nicotiana tabacum),
gula pasir, HCl 1M, karet, label,
Medium Murashige dan Skoog (Medium
MS), NaOH 1M, plastic wrap, dan zat
pengatur tumbuh (NAA&BA)
Percobaan ini dibagi menjadi 2
tahap, yaitu pembuatan media yang
dilakukan pada tanggal 4 September
2017, dan penanaman eksplan yang
dilakukan pada 11 September 2017.
Pembuatan media diawali
dengan dimasukannya medium MS (4,4
g/L dalam 200 ml) ke dalam gelas kimia
250 ml yang sudah diisi akuades 100 ml.
Medium MS kemudian ditambahkan
gula sebanyak 1 spatula dan NAA dan
BAA masing-masing sebanyak 1µM.
Medium dituangkan ke dalam gelas ukur
dan ditambahkan air hingga volume
larutan mencapai 200 ml. Setelah itu
larutan dituangkan kembali ke gelas
kimia dan ditentukan keasamannya
dengan menambahkan NaOH atau HCl
1M. Langkah berikutnya adalah
ditambahkan agar-agar sebanyak 8 g/L
lalu dididihkan di atas hotplate. Setelah
itu larutan dituangkan ke 5 botol kultur
kemudian ditutup dengan alumunium
foil, karet, dan plastic wrap, setelah itu
masing-masing botol diberi label A, B,
C, D, dan E. Botol-botol kultur
kemudian disterilisasi menggunakan
autoklaf pada suhu 121ºC dengan
tekanan 1,5 kg/cm2.
Setelah media dibuat, yang
selanjutnya dilakukan adalah
penanaman eksplan. Penanaman
eksplan. Penanaman eksplan dilakukan
di laminar air flow cabinet yang steril.
Tanaman-tanaman yang akan ditanam
menggunakan metode kultur jaringan
sudah disterilkan sehingga tidak perlu
disterilisasi lagi menggunakan larutan
NaClO. Penanaman eksplan daun
ginseng jahe cukup dipetik saja
menggunakan pinset dan scalpel karena
ukuran daunnya sudah kecil, sementara
daun tembakau harus dipotong menjadi
berukuran 1x1 cm terlebih dahulu
menggunakan pinset dan scalpel,
kemudian bias ditanam. Daun yang
sudah siap kemudian ditanamkan pada
media dengan posisi bagian bawah daun
menghadap ke atas. Botol A dan B berisi
kultur ginseng jawa, botol C, D, dan E
berisi kultur tembakau. Terakhir,
eksplan diletakkan di rak kultur pada
suhu ruangan dengan penerangan lampu
TLD. Setelah penanaman dilakukan
pengamatan selama 6 minggu sambal
dilakukan diferensiasi yang terjadi.
Diperhatikan apakah tumbuh pucuk,
akar, atau kalus. Hasil pengamatan
didiskusikan dan disimpulkan.
PEMBAHASAN
Kultur jaringan adalah metode
perbanyakan tanaman menggunakan
jaringan, sel, atau suatu organ pada
tanaman pada media buatan yang diatur
secara aseptik dan dapat ditumbuhkan
membentuk tanaman lengkap (plantlet).
(Mariska dan Rahayu, 2011)
Pembuatan kultr jaringan pada
praktikum ini menggunakan medium
MS. Kandungan medium ms meliputi
makronutrien, mikronutrien, dan
suplemen organik. Makronutrien yang
terkandung dalam media MS terdiri dari
NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O,
MgSO4.7H2O, dan KH2PO4.
Mikronutrien yang terkandung dalam
media MS terdiri dari KI, H3BO3,
MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O,
Na2MoO4.2H2O, CuSO4.5H2O,
CoCl2.6H2O, Na2EDTA, dan
FeSO4.7H2O. Suplemen organik yang
terkandung dalam media MS terdiri dari
Inositol, Nicotinic acid, Pyridoksin‐HCl,
Tiamin‐HCl, Glysin, dan Sukrosa.
(Sitorus, dkk, 2011) Nitrogen dalam
KNO3 dan NH4NO3 bekerja sebagai
penyusun protein klorofil, asam nukleat,
dan enzim. Kalsium dalam CaCl2.2H2O
berfungsi untuk membentuk garam asam
pektat, kofaktor enzim, dan menjaga
permeabilitas membran. Kalium dalam
KH2PO4 dan KNO3 bekerja sebagai
activator atau kofaktor enzim.
Magnesium dalam MgSO4.7H2O
berfungsi sebagai kofaktor/aktivator
enzim dan zat penyusun klorofil. Boron
H3BO3 berfungsi sebagai zat pengatur
perkecambahan, zat pengatur translokasi
gula, pembungaan, pembuahan,
pembelahan sel, dan metabolisme
nitrogen. Mangan dalam MnSO4.4H2O
berfungsi untuk pengaktifan enzim dan
sintesis klorofil. Seng dalam
ZnSO4.7H2O berfungsi untuk sintesis
triptofan, aktivator enzim ,dan mengatur
pembentukan kloroplas dan amilum.
Molibdenum dalam Na2MoO4.2H2O
berfungsi sebagai komponen enzim yang
mereduksi nitrat menjadi nitrit, dan
fiksasi N dalam bakteri. Tembaga dalam
CuSO4.5H2O berfungsi untuk transfer
electron dalam kloroplas. Kobalt dalam
CoCl2.6H2O berfungsi untuk fiksasi
nitrogen dan aktivator enzim, Zat besi
dalam FeSO4.7H2O berfungsi untuk
pembentukan klorofil, komponen enzim
sitokrom, katalase, dan peroksidase.
Na2EDTA berfungsi sebagai penstabil
ion metal pada tumbuhan. (Azzamy,
2015)
Dalam kultur jaringan zat
pengatur pertumbuhan mempunyai
peran yang sangat penting. Sitokinin dan
auksin adalah dua zat pengatur
pertumbuhan yang penting bagi
tanaman. Sitokinin terbuat dari BA
(benzyl adenine), kinetin (furfural amino
puril), 2-1p(dimethyl allyl amino purin),
dan zeatin. Sementara auksin terbuat
dari IAA (indole acetic acid), NAA
(naphthalene acetic acid), IBA (Indole
butyric acid), 2,4-D(4-amino-3,5,6-
tricloropicolinic). (Lestari, 2011)
Sitokinin dan auksin bekerja sama
dalam mengarahkan pertumbuhan
tanaman, sitokinin berfungsi untuk
merangsang pembelahan sel pada
tanaman, sedangkan auksin
mengarahkan arah diferensiasi sel. Jika
kadar sitokinin lebih banyak dari kadar
auksin, maka pertumbuhan tunas dan
daun yang akan terstimulasi, sedangkan
jika kadar auksin lebih banyak dari
sitokinin, pertumbuhan akar tanaman lah
yang akan terstimulasi. Jika kadar
keduanya ada pada perbandingan yang
sama, maka pertumbuhan tanaman akan
seimbang. (Karjadi dan Buchory, 2008)
Kultur jaringan kelompok 9
mendapat perlakuan pemberian NAA
dan BA masing-masing 1µM. Pada
minggu pertama setelah ditanam botol B
mengalami kontaminasi jamur,
sementara pada botol lainnya belum
terjadi perubahan apa-apa. Minggu
kedua, botol A menunjukkan
pertumbuhan kalus berwarna hijau,
sementara botol lainnya belum
menunjukkan perubahan. Minggu ketiga
progress pertumbuhan masih sama
seperti minggu ke dua. Minggu terakhir
pengamatan botol C terkontaminasi
jamur, botol A masih berupa kalus,
sedangkan botol D dan E tidak
menunjukkan perubahan apa-apa.
Data kompilasi menunjukkan
bahwa pertumbuhan kultur kelompok 1,
yaitu pada penggunaan masing-masing
0M hormon. Kultur tembakau
bertumbuh menjadi kalus, sementara
kultur ginseng jawa bertumbuh menjadi
akar pada kultur kelompok 1. Padahal
menurut Jokopriyambodo, dkk (1999)
perbandingan hormon yang paling baik
dalam menumbuhkan ginseng jawa
adalah NAA 3 mg/L dan BAP 0,5 mg/L.
Sementara untuk tanaman tembakau,
perbandingan hormon yang paling baik
untuk pertumbuhan kalus adalah 3 ppm
BAP dan 0,1 ppm NAA juga 1 ppm
BAP dan 0,2 ppm NAA. (Nisak, dkk,
2012) Perbedaan antara hasil dan
literatur yang ditemukan merupakan
pengaruh dari proses penanaman kultur.
Ada beberapa kultur yang
terkontaminasi jamur atau bakteri
sehingga hasil yang dihasilkan pada
kelompok-kelompok yang kulturnya
terkontaminasi kurang akurat.
KESIMPULAN
Pemberian NAA dan BA dalam
kultur jaringan mempengaruhi arah
pertumbuhan dari kultur jaringan,
seperti pembentukan akar, pucuk,
ataupun kalus. Konsentrasi optimum
untuk menumbuhkan kultur jaringan
yang didapatkan pada percobaan ini
adalah 0M NAA dan 0M BA.
DAFTAR PUSTAKA
Ali, Gowher, Fazal Hadi,
Muhammad Tariq, dan
Muhammad Ali Khan . 2007 .
“Callus Induction and in vitro
Complete Plant Regeneration
of Different Cultivars of
Tobacco (Nicotiana tabacum
L.) on Media of Different
Hormonal Concentrations” .
Biotechnology 6:561-566.
Azzamy. 2015. “Fungsi
Makronutrien dan
Mikronutrien pada
Tumbuhan” [Website]
http://www.modulbiologi.co
m/fungsi-makronutrien-dan-
mikronutrien-pada-tumbuhan/
Diakses pada 14 Oktober
pukul 13.13.
Barz, W. Reinhard E. . 1978. Plant
Tissue Culture and It’s Bio-
technology application.
Oregon : Springer-Verlog
Berlin Heidelberg
Gunawan, L.W.. 1988. Teknik Kultur
Jaringan. Bogor : Institut
Pertanian Bogor.
Hermawan, T., dan B. Ismail. 2009.
“Penggunaan Kombinasi
Auksi dan Sitokinin untuk
Menginduksi Tunas pada
 Kultur Jaringan Sengon 2011. “Induksi Kalus
(Falcataria moluccana) Binahong (Basella rubra L.)
Menggunakan Bagian Secara In Vitro Pada Media
Kotiledon.” Jurnal Murashige & Skoog Dengan
Pemuliaan Tanaman Hutan. Konsentrasi Sukrosa Yang
3(1): 23-31 Berbeda. Bioma 13(1):144-
Jokopriyambodo, Wahyu, Slamet 150
Wahyono, dan Djumidi Trigiano, Robert N. & Gray, Dennis
Djumidi. 1999. J. . 2010. Plant Tissue
“Organogenesis Batang Som Culture, Development and
Jawa (Talinum paniculatum Biotechnology. Boca Raton:
Gaertn.) Secara In Vitro”. CRC Press
Warta Tumbuhan Obat
Indonesia. 5(4):29-39
Karjadi, A.K. dan A. Buchory. 2008.
“Pengaruh Komposisi Media
Dasar, Penambahan BAP, dan
Pikloram terhadap Induksi
Tunas Bawang Merah” .
Jurnal Hortikultura 18(1):1-
9.
Lestari, E.G.. 2011. “Peranan Zat
Pengatur Tumbuhan dalam
Perbanyakan Tumbuhan
melalui Kultur Jaringan”.
AgroBiogen 7(1):63-68
Mariska, Ika dan Suci Rahayu. 2011.
“Pengadaan Bibit Tebu
melalui Kultur Jaringan”.
Jurnal Litbang Pertanian
6:24-30
Nisak, K, Tutik Nurhidayati, dan
Kristanti I. Purwani.
“Pengaruh Kombinasi
konsentrasi ZPT NAA dan
BAP pada Kultur Jaringan
Tembakau Nicotiana
tabacum var. Prancak 95”.
Jurnal Sains dan Seni Pomits
1(1):1-6
Sitorus, Ertina Novaria, Endah Dwi
Hastuti, dan Nintya Setiari.
 LAMPIRAN

Tabel 1. Tabel dokumentasi kultur jaringan kelompok 9

Minggu ke- Foto Keterangan
Keterangan foto dari
kiri ke kanan secara
mengulang : Tabung
A, kultur ginseng
jawa, belum mulai
tumbuh. Tabung B,
1 kultur ginseng jawa,
terkontaminasi
jamur. Botol C, D,
E, kultur tembakau,
belum terjadi apa-
apa

Keterangan foto dari

kiri ke kanan secara
mengulang : Tabung
A, kultur ginseng
jawa, tebentuk kalus
berwarna hijau
2 muda. Tabung C, D,
E, kultur tembakau,
tidak terjadi apa-apa

Keterangan foto dari

kiri ke kanan secara
mengulang : Tabung
A, kultur ginseng
jawa, terbentuk
kalus. Tabung B,
3 kultur ginseng jawa,
terkontaminasi
jamur. Botol C, D,
E, kultur tembakau,
belum terjadi apa-
apa
 Keterangan foto dari
kiri ke kanan secara
mengulang : Tabung
A,. Botol C, kultur
tembakau,
4
terkontaminasi
jamur. Botol D dan
F masih belum
terjadi apa-apa.

Tabel 2. Tabel kompilasi dokumentasi kultur jaringan angkatan

Konsentrasi
Kelom Hormon Dokumentasi Pengamatan Terakhir (9
Keterangan
pok NAA BA Oktober 2017)
(µM) (µM)
Botol kultur 1-5 berurutan
dari kiri ke kanan. Botol 1-3
adalah kultur daun Nicotiana
tabavum L. yang tumbuh
dengan baik dan
1 0 0 memembentuk kalus. Botol 4
dan 5 adalah botol kultur
daun Talium paniculatum L.
yang tumbuh dengan
dominasi pertumbuhan pada
akar.
Botol A (a) kultur tembakau
tidak tumbuh dan
terkontaminasi pada minggu
ke 3
Botol C (b) kultur tembakau
tidak tumbuh dan
terkontaminasi pada minggu
ke 3
Botol C (c) kultur tembakau
(a) (b) (c) tidak tumbuh dan
2 0 0,1 terkontaminasi pada minggu
ke 3
Botol D (d) kultur ginseng
tidak tumbuh akar tapi hanya
tumbuh batangnya saja
Botol E (e) kultur ginseng
terkontaminasi pada minggu
ke 1

(d) (e)
 Botol atas : kultur tembakau
tidak tumbuh dan
terkontaminasi pada minggu
ke 4
Botol bawah : kultur ginseng
tidak tumbuh dan
3 0 1,0 terkontaminasi pada minggu
ke 3 dan minggu ke 4

Botol kultur 1 sampai 3

berturut-turut dari kiri ke
kanan:
Botol 1 kultur gingseng jawa
tidak tumbuh dan tidak
terjadi apa-apa (tidak
tumbuh akar)
Botol 2 kultur tembakau
4 0,1 0 tidak tumbuh dan tidak
terjadi apa-apa
Botol 3 kultur gingseng jawa
tumbuh akar
Yang terkontaminasi:
Botol 4 kultur tembakau
terjadi pembentukan jamur
pada minggu ke-2 (botol
sudah dipisahkan)

Atas : Botol A dan B

Tengah : Botol C dan D
Bawah : Botol E

Botol A adalah daun

tembakau yang kondisi
akhirnya tidak tumbuh apa-
5 0,1 0,1 apa. Botol B adalah daun
gingseng jawa pada kondisi
akhirnya yang tidak tumbuh
apa-apa pada daun tersebut.
Botol C dan D adalah daun
tembakau pada kondisi akhir,
pada botol C tidak tumbuh
apa-apa. Pada botol D
tumbuh akar pada bagian
 atas daun, namun terdapat
rambut berwarna putih yang
diasumsikan merupakan
jamur. Botol E adalah daun
ginseng jawa yang pada
kondisi akhir. Tidak tumbuh
apapun pada daun ginseng
pada botol E.

Botol kultur 1 sampai 4 dari

kiri ke kanan : Botol 1 dan 3
kultur tembakau, ada
pertumbuhan akar dan
sedikit kalus.
Botol 2 dan 4 merupakan
6 0.1 1
botol kultur ginseng dan
tidak terjadi apa apa.

Botol kultur 1 samapai 5 dari

kiri kekanan. Botol 1 adalah
kultur ginseng dan terdapat
pertumbuhan kalus.
7 1 0
Botol 2, 3, 4, dan 5 adalah
kultur tembakau, mengalami
kontaminasi yakni pada
minggu ke dua.
Botol kultur A, B, D, E
mengalami pertumbuhan
kalus. Botol A dan B
(ginseng jawa) mengalami
8 1 0,1 pertumbuhan kalus sejak
minggu ke 2 sedangkan botol
D dan E (tembakau)
mengalami pertumbuhan
kalus pada minggu ke 4.
 Botol C (ginseng jawa)
mengalami kontaminasi
berupa jamur pada minggu
ke 2.

Botol kultur 1 sampai 4

berturut-turut dari kiri ke
kanan : Botol kultur 1, kultur
ginseng jawa tumbuh
menjadi kalus. Botol kultur
2, kultur tembakau
terkontaminasi pada minggu
9 1 1
ke 6. Botol kultur 3, kultur
tembakau, tidak tumbuh.
Botol kultur 4, kultur
tembakau tidak tumbuh.
Botol kultur 5, kultur
ginseng jawa terkontaminasi
sejak minggu ke-2.
Botol 5 kultur gingseng
jawa mengalami kontaminasi
pada minggu ke-2.
Botol 3 kultur jaringan
tembakau tidak tumbuh &
mengalami kontaminasi pada
minggu ke-2.
Botol 2 kultur jaringan
10 0 0
tembakau mengalami
pertumbuhan akar pada
minggu ke-2 dan pada
minggu ke-3 botol 2
mengalami kontaminasi.
Botol 1 kultur jaringan
mengalami pertumbuhan
akar pada minggu ke-2.
Botol kultur 3 sampai 5
berturut-turut dari kiri ke
kanan adaah botol kultur 3,
botol kultur 4, dan botol
kultur 5. Botol kultur 3 dan 4
: daun tembakau tidak
11 1 1 tumbuh apa-apa. Botol kultur
5 : daun ginseng jawa
tumbuh kalus.
Botol kultur 1 :
terkontaminasi sejak minggu
ke-2 (botol telah dipisahkan)
Botol kultur 2 :
 terkontaminasi sejak minggu
ke-4 (botol terlah
dipisahkan)

Tabel 3. Tabel kompilasi hasil pengamatan kultur jaringan angkatan

KonsentrasiHormon Pengamatan yang Terlihat (dalam botol kultur jaringan)
Kelompok NAA BA Tidak
kalus daun akar kontaminasi
(µM) (µM) tumbuh
1 0 0 1 - 4 - -
2 0 0,1 - 3 - - 4
3 0 1 - - - - 5
4 0,1 0 - - 1 2 2
5 0,1 0,1 - - - 4 1
6 0,1 1 3 - - 2 -
7 1 0 1 - - - 4
8 1 0,1 4 - - - 1
9 1 1 1 - - 2 2
10 0 0 - - 1 - 4
11 1 1 1 - - 2 2