DNA SEKUENSING

Metode Sanger

Kelompok 1
Nurbayani (2-4)
Ulul azmi (5-7)
Nurhadijah (8-11)
Sahara (12-19)

Pengertian
Sekuensing DNA atau pengurutan
DNA adalah proses atau teknik
penentuan urutan basa nukleotida pada
suatu molekul DNA.
Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens
DNA, yang merupakan informasi paling
mendasar suatu gen atau genom karena
mengandung instruksi yang dibutuhkan
untuk pembentukan tubuh makhluk hidup.

Manfaat
Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan
untuk menentukan identitas maupun
fungsi gen atau fragmen DNA lainnya
dengan cara membandingkan sekuensnya dengan sekuens DNA lain yang
sudah diketahui.
Teknik ini digunakan dalam riset dasar
biologi maupun berbagai bidang terapan
seperti kedokteran, bioteknologi,
forensik, dan antropologi.

Metode Sanger
Metode Sanger Memerlukan :

DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA

Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan
template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi
DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida
baru keujung 3 dari template
Sejumlah nukeotida normal
Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan
pewarna fluorescent)
Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara
random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan).
Penambahan dideoxynukeotida menyebabkan reaksi berhenti
Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi ,masing-masing berhenti
pada DD nukleotida tertentu yang dilabel.
Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang
berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

Tahapan Sekuensing Metode

Sanger :
1. Tahapan sekuensing yang pertama
adalah menyediakan ds DNA (double
strand DNA)
2. Memotong dsDNA (double strand DNA)
menjadi ssDNA (single strand DNA)

 3. Mengambil template (cetakan) DNA

dari ssDNA hasil potongan dari dsDNA
tadi

4.Menyediakan seluruh alat dan bahan

untuk sekuensing DNA.

 Bahan untuk sekuensing adalah template

(cetakan) DNA, primer, dNTP, ddNTP dan
enzym polymerase.

 Template DNA berfungsi sebagai cetakan.

Primer berfungsi sebagai landasan/pijakan yang
mengenal situs spesifik pada DNA template
untuk memulai proses polymerase.
dNTP (deoksinukleotida tri phospat) berfungsi
sebagai sumber nukleotida pada proses
polymerase sekuensing. dNTPada 5 jenis,
yaitudATP (deoksiadenin tri phospat), dGTP
(deoksiguanin tri phospat), dUTP (deoksiurasil
tri phospat), dCTP (deoksicitosin tri phospat),
dandTTP (deoksitimin tri phospat).

 ddNTP (dideoksinukleotida tri phospat)

berfungsi untuk menghentikan/terminasi
proses enzim polymerase, sehingga
proses perbanyakan nukleotida terhenti.
Enzym polymerase berfungsi untuk reaksi
polimerisasi atau perbanyakan nukleotida.

 5. Menyiapkan 4 tabung reaksi. Masing-masing

tabung reaksi diberikan ddNTP, yaitu ddGTP,
ddCTP, ddATP, dan ddTTP. Masing-masing
tabung reaksi diisi dengan ddNTP yang
berbeda. Tabung pertama diisi dengan ddGTP,
tabung kedua diisi dengan ddCTP, tabung
ketiga diisi dengan ddATP, dan tabung keempat
diisi dengan ddTTP.

6. Setelah masing-masing tabung diisi

dengan ddNTP, kemudian masing-masing
tabung diisi dengan dNTP, sebagai
sumber
nukleotida
pada
proses
polimerasi. Yaitu dGTP, dCTP, dATP, dan
dTTP.

 9. Setelah pemberian primer, juga

dimasukkan enzim polimerase (taqpolymerase). Enzim polimerase memulai
proses polimerisasi.

7. Memasukkan dNTP kedalam tabung

reaksi tadi.

8.
Kemudian
memasukkan
primer
kedalam tabung reaksi. Primer berfungsi
mengenal isitus spesifik pada DNA
template,
juga
berfungsi
sebagai
landasan/pijakan
untuk
memulai
polimerisasi.

 10. Enzim polymerase terus

mengkatalisis pembentukan
polinukleotida dari nukleotida dNTP
(deoksinukleotida tri phospat)

 11. Pada saat enzim taq-polymerase

mengkatalisis pembentukan ikatan antara
nukleotida, deoksi-nukleotida (ddNTP)
hadir berikatan dengan polimer nukleotida
sebelumnya.

 13.Kehadiran ddNTP (deoksinukleotida)

mengakibatkan terhentinya/terminasi
proses polimerase, sehingga dihasilkan
rantai polinukleotida yang berbeda
panjangnya

 14.Kegiatan nomor 9 sampai nomor 13

dilakukan pada semua tabung reaksi

15.Keempat tabung reaksi tersebut

dipersiapkan untuk di alirkan pada gel
agarosa

 16.Perbedaan panjang polinukleotida

tersebut, mengakibatkan perbedaan letak
pada gel agarosa. Polinukleotida yang
paling pendek bermigrasi/pergerakannyaa
paling cepat pada gel agarosa.

 17. Hasil pembacaan sekuensing dari

arah 5 ke 3 adalah rantai kompemen,
yaitu 5 AGCCGATCC 3.Sehingga DNA
templatenya adalah 5 GGATCGGCT 3

THANKS FOR LISTENING