Laporan Praktikum Hari, Tanggal : Jum’at, 2 Maret & 13 April

Teknik Asam Nukleat 2018

PJP : Puspa Julistia P, M.Si
Asisten : Kharina MQ
Giga Genggam GG
Salma Adilah H
Fitria Zahra O

ISOLASI DNA TEMULAWAK BERBAGAI AKSESI

(Isolasi DNA Temulawak Metode Doyle dan Analisis Hasil dengan
Elektroforesis Gel)

Kelompok 2

Aulia Ayu Rispriandari G84150012

Fatmawati G84150029
Krisdianty G84150032
Felix Martine G84150065

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018
 PENDAHULUAN

Salah satu bentuk molekul asam nukleat yang terdapat dalam tubuh adalah
DNA (deoxyribonucleic acid) yang memiliki monomer berupa nukleotida. Molekul
ini tersusun dari gula pentosa berupa deoksiribosa, fosfat, dan basa nitrogen
heterosiklik berupa purin yang terdiri dari adenin serta guanin, dan basa nitrogen
pirimidin yang terdiri dari sitosin serta timin (Sumardjo 2006). DNA yang melilt
protein histon membentuk struktur yang disebut nukleosom. Nukleosom yang
tersusun sepanjang rantai DNA membentuk struktur yang disebut kromosom.
Umumnya, kromosom diambil pada bagian jaringan yang sedang aktif membelah
seperti ujung batang, ujung akar, lingkar cambium, kelenjar, epitel, dan tulang.
Daerah kecil pada kromosom yang merupakan satu unit yang tidak dapat membelah
serta diwariskan dari generasi ke generasi disebut dengan gen (Nusantari 2015).
Isolasi DNA dapat dilakukan pada sel hewan, tanaman, dan manusia. Isolasi
DNA manusia dapat dilakukan melalui sel darah berupa leukosit karena sel ini
memiliki inti sel yang mengandung DNA. Tahap utama isolasi DNA adalah isolasi
sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan
presipitasi. Selain itu, dapat juga dilakukan isolasi DNA plasmid dari bakteri. Untuk
melakukan isolasi plasmid, sel bakteri ditumbuhkan lalu dipanen. Kemudian
dinding dan membran dihancurkan sehingga ekstrak dapat keluar. Ekstrak ini
mengalami serangkaian perlakuan untuk memperoleh plasmid murni (Faatih 2009).
Isolasi DNA dari darah dapat menggunakan metode Robyt & White (1987) (Susilo
et al. 2011).
Prinsip isolasi DNA adalah memperoleh DNA murni. Isolasi DNA genom
dapat dilakukan menggunakan metode lisis sel secara fisik dengan menggunakan
kekuatan mekanik untuk memecah sel seperti freeze thaw, bead mill
homogenization, dan resonansi seperti sonikasi, maupun secara kimia yang
menggunakan buffer lisis yang merusak integritas barrier dinding sel seperti SDS
dan CTAB (Murtiyaningsih 2017). Untuk mengisolasi DNA tanaman perlu
menggunakan metode yang berbeda. Tahapan-tahapan dalam metode tersebut
adalah perusakan dinding sel, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa
dan protein, kemudian yang terakhir adalah pemurnian DNA (Langga et al. 2012).
Tanaman temulawak merupakan tanaman obat-obatan yang mengandung
metabolit sekunder seperti kurkuminoid, minyak atsiri, dan pati. Xanthorizol
merupakan salah satu komponen minyak atsiri yang berperan sebagai agen
penginduksi apoptosis, antibakteri, antiinflamasi, dan antioksidan. Faktor
lingkungan dapat berpengaruh terhadap metabolit sekunder. Hal ini menyebabkan
timbulnya polimorfisme DNA pada tanaman temulawak. Untuk menganalisis
polimorfisme DNA temulawak, tahap pertama yang harus dilakukan adalah isolasi
DNA temulawak (Utami et al. 2012).
Beberapa metode isolasi DNA menggunakan CTAB dan SDS dalam
mengisolasi DNA tanaman. Beberapa metode lain juga dapat menggunakan
nitrogen cair pada tahap ekstraksi. Protokol Doyle merupakan metode yang sering
digunakan untuk ektraksi DNA tanaman. Metode ini menggunakan buffer ektraksi
yang mengandung CTAB, NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-merkaptoetanol (Utami
et al. 2012). Larutan CTAB ini merupakan detergen kationik yang dapat
menghancurkan dinding sel, menguraikan protein, serta memisahkan DNA dari
karbohidrat (Nugroho et al. 2017). Beberapa metode isolasi DNA dapat
dimodifikasi untuk melakukan optimalisasi. Hal ini ditujukan agar diperoleh DNA
yang banyak serta kontaminasi sedikit (Utami et al. 2012). Praktikum ini bertujuan
mengisolasi DNA daun temulawak dari berbagai aksesi dengan metode Doyle lalu
mengidentifikasi hasilnya melalui elektroforesis gel agarosa.

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan pada hari Jumat 13 April 2018 di Laboratorium

Pendidikan Departemen Biokimia FMIPA IPB lantai 5, gedung fakultas
peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah mortar, eppendorf, pipet
mikro, tip, autoklaf dan seperangkat alat gelas. Bahan yang digunakan adalah daun
temulawak berbagai aksesi, es batu, PVP, 0.75 ml buffer ekstraksi (2% b/v CTAB,
1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris –HCl pH 8 ,0.2% (v/v) merkaptoetanol,
kloroform : isoamil alcohol (24:1 ), isopropanol, molecular water.

Prosedur Praktikum

Isolasi DNA Temulawat Metode Doyle. Sebanyak 0.2 gram daun yang
sudah dicuci dan di potong- potong di timbang. Daun digerus menggunakan PVP
dan 0.75 buffer ekstraksi. Sampel selanjutnya di inkubasi dengan incubator
bergoyang pada suhu 65o Cdengan kecepatan 50 rpm selama satu jam dan dibiarkan
pada suhu ruang untuk proses pendinginan. Sebanyak 0.75 ml klorofotm : isoamil
alkohol (24:1 ) dan disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4o C. Sampel selanjutnya dipindahkan ke supernatan dan ditambahkan dengan
2/3 volume isopropanol dingin dan dilakukan inversi perlahan sebanyak 10 kali.
Sampel di sentrifugasi kembali pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit pada
suhu 4oC. Hasil yang diambil adalah pellet dan ditambahkan 25 µL moleculr water
dan disimpan pada suhu -20oC untuk dianalisis selanjutnya.

Elektroforesis DNA Plasmid Terestriksi. Sebanyak 5 µL DNA

ditambahkan dengan 1 µL dye dan disuspensikan. Suspensi diinjeksikan ke dalam
sumur agar dan dielektroforesis selama 45 menit dengan tegangan 60 V. Hal serupa
juga dilakukan pada marker. Hasil elektroforesis kemudian dilihat dengan
menggunakan UV transiluminator.
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Prinsip utama dalam isolasi DNA adalah sentrifugasi dan presipitasi.

Sentrifugasi dilakukan untuk pemisahan subtansi berdasarkan berat molekulnya
dengan menggunakan gaya sentrifugal (Faatih 2009). Isolasi DNA tanaman
temulawak dilakukan dengan menggunakan metode Doyle. Larutan CTAB
berperan dalam menghacurkan dinding sel, menguraikan protein, serta memisahkan
DNA dari komponen lainnya seperti karbohidrat. Penghancuran dinding sel juga
dapat menggunakan nitrogen cair. Nitrogen cair selain menghancurkan dinding sel
juga dapat menonaktifkan komponen kimiawi, tetapi senyawa ini tidak aman
digunakan sehingga memerlukan penyimapan khusus (Nugroho et al. 2017).
Penambahan PVP dan merkaptoetanol berperan sebagai antioksidan yang
mencegah oksidasi dari senyawa polifenol. Senyawa ini berasal dari vakuola dan
terdapat pada saat proses penghancuran jaringan. Senyawa polifenol ini dapat
teroksidasi dan berikatan kovalen dengan protein dan DNA yang menghasilkan
warna coklat pada larutan ektrak. Selain itu, penambahan 2-merkaptoetanol juga
dapat mendegradasi protein dengan cara mengurai ikatan sulfat pada protein
(Nugroho et al. 2017).
Larutan garam seperti NaCl berperan dalam meningkatkan kelarutan
senyawa polisakarida sehingga polisakarida tidak mengendap Bersama DNA saat
sentrifugasi. Konsentrasi garam yang tinggi dapat meningkatkan kelarutan
polisakarida ini. Penambahan larutan organik seperti fenol : kloroform berfungsi
dalam menggumpalkan protein sehingga setelah disentrifugasi akan mengendap.
Setelah tahap ini, protein akan berada pada lapisan bawah, sedangkan DNA berada
pada fase cair yang berada pada lapisan atas (Nugroho et al. 2017).
Penambahan isopropanol dingin ditujukan untuk presipitasi DNA
(Syafaruddin et al. 2011). Penggunaan buffer TE atau akuades steril bertujuan
untuk mengelusi DNA atau melarutkan DNA (Farmawati et al. 2015). Isolasi DNA
temulawak dilakukan menggunakan sampel dari berbagai aksesi. Terdapat
polimorfisme DNA temulawak sehingga isolasi DNA temulawak menggunakan
sampel dari berbagai aksesi (Utami et al. 2012). Merujuk gambar 1 diperoleh hasil
elektroforesis temulawak dari berbagai aksesi. Hasil elektroforesis menunjukkan
bahwa isolasi DNA tidak berhasil Elektroforegram menunjukkan terdapat smear
pada hasil pita DNA setiap sampel dan DNA ladder.

Gambar 1 Elektroforegram hasil elektroforesis DNA temulawak

 Terbentuknya smear ini dapat disebabkan oleh adanya materi lain seperti
sisa larutan yang terbawa selama proses isolasi atau DNA yang terdegradasi
(Mulyani et al. 2011). Selain itu, perlakuan penggerusan sampel juga
mempengaruhi hasil pita DNA yang terbentuk. Sampelyang digerus lebih halus
memberi hasil pita DNA yang lebih baik. Daun yang tidak digerus secara sempurna
mengakibatkan sel-sel daun tidak lisis secara keseluruhan sehingga penambahan
buffer lisis tidak efektif untk memisahkan isi sel dengan debris sel. Hal ini
menyebabkan pita DNA yang terbentuk pada elektroforegram menjadi tipis dan
tidak jelas. Sementara sampel yang digerus secara sempurna ketika ditambahkan
buffer lisis, isi sel dan debris sel akan terpisah secara sempurna sehingga pada
elektroforegram akan terbentuk pita DNA yang lebih jelas (Ferniah dan Pujiyanto
2013).
Perlakuan pendinginan sampel juga berpengaruh pada hasil isolasi DNA.
Sampel daun yang didinginkan akan menjadi lebih lunak dan tipis sehingga mudah
dalam penggerusan sampel. Pendinginan sampel ini dapat dilakukan selama satu
malam. Perlakuan pendinginan ini umumnya digunakan untuk mengganti peran
nitrogen cair, oleh sebab itu pemilihan jenis buffer lisis juga berpengaruh terhadap
hasil isolasi DNA (Ferniah dan Pujiyanto 2013). Beberapa metode isolasi DNA
umumnya dimodifikasi untuk memperoleh DNA yang lebih banyak dan sedikit
terkontaminasi (Utami et al. 2012).
Selain itu, konsentrasi buffer juga berpengaruh terhadap hasil isolasi DNA.
Buffer TE dengan konsentrasi yang tidak sesuai akan mengganggu kelarutan DNA
(Syafaruddin et al. 2011). Buffer dengan konsentrasi CTAB, garam, dan 2-
merkaptoetanol yang rendah akan menyebabkan semakin sedikitnya DNA yang
terlarut dan adanya kontaminan berupa protein yang belum terpisah dari ekstrak
DNA (Nugroho et al. 2017).

SIMPULAN

Isolasi DNA temulawak dari berbagai aksesi dilakukan dengan metode

Doyle. Kemudian hasil isolasi dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa.
Isolasi DNA temulawak praktikum ini tidak berhasil dilihat dari elektroforegram
yang memberikan hasil yang baik. Setiap sampel dan DNA ladder membentuk
smear dan pita DNA yang tidak jelas pada elektroforegram. Kesalahan yang terjadi
ini dapat disebabkan karena adanya kontaminasi dari komponen lain selama proses
isolasi, penggerusan sampel yang tidak sempurna, tidak adanya perlakuan
pendinginan sampel sebelum isolasi, dan penggunaan buffer dengan konsentrasi
yang tidak sesuai.

DAFTAR PUSTAKA

Faatih M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. J. Penelitian Sains &
Teknologi. 10(1): 61-67.
Farmawati DA, Wirajana In, Yowani SC. 2015. Perbandingan kualitan DNA
dengan menggunakan metode boom original dan boom modifikasi pada
isolat Mycobacterium tuberculosis 151. J. Kimia. 9(1): 41-46.
Ferniah RS, Pujiyanto S. 2013. Optimasi isolasi DNA cabai (Capsicum annuum L.)
berdasa perbedaan kualitas dan kuantitas serta teknik penggerusan. Bioma.
156(1): 14-19.
Langga IF, Restu M, Kuswinanti T. 2012. Optimalisasi shu dan lama inkubasi
dalam ekstraksi DNA tanaman bitti (Vitex cofasus Reinw) serta analisis
keragaman genetik dengan teknik RAPD-PCR. J. Sains & Teknologi. 12(3):
265-276.
Mulyani Y, Purwanto A, Nurruhwati I. 2011. Perbandingan beberapa metode
isolasi DNA untuk deteksi dini Koi Herpes Virus (KHV) pada ikan mas
(Cyprinus carpio L.). J. Akuatika. 2(1): 1-16.
Murtiyaningsih H. 2017. Isolasi DNA genom dan identifikasi kekerabatan genetik
nanas menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Agritrop.
15(1): 83-93.
Nugroho K, Terryana RT, Lestari P. 2017. Metode ekstraksi DNA cabai (Capsicum
annuum L.) menggunakan modifikasi buffer CTAB (Cethyl Trimetyl
Ammonium Bromide) tanpa nitogen cair. Scripta Biologica. 4(2): 91-94.
Nusantari E. 2015. Genetika: Belajar Genetika dengan Mudah & Komprehensif.
Yogyakarta (ID): Deepublish.
Sumardjo D. 2006. Pengantar Kimia: Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta (ID):
Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Susilo A, Soeparno, Hartati T, Artama WT. 2011. Amplifikasi DNA gen meat
tenderness pada sapi bali (Bos sondaicus). J. Ilmu dan Teknologi Hasil
Ternak. 6(2): 21-25.
Syafaruddin, Randriani E, Santoso TJ. 2011. Efektivitas dan efisiensi teknik isolasi
dan purifikasi DNA pada jambu mete. Buletin RISTRI. 2(2): 151-160.
Utami A, Meryalita R, Prihatin NA, Ambarsari L, Kurniatin PA, Nurcholis W.
2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (Curcuma xanthorrhiza
Roxb.). Di dalam: Seminar Nasional Kimia Unesa; Feb 25, 2012; Surabaya,
Indonesia. Hal: 205-214.