Kromatografi Partisi
(partition chromatography)
High Performance
HP High Pressure
L Liquid
Cairan sebagai Fase gerak
Chromatography
C Teknik Pemisahan
2. PENGGUNAAN/Manfaat
• Untuk senyawa organik yang tidak stabil bila dipanaskan
Prinsip
• Terdiri dari fasa diam, dg permukaan aktifnya berupa
padatan, larutan, resin penukar ion atau polimer berpori
• Fasa diam ditempatkan pd kolom serta dialiri fasa gerak
cair dg aliran yg diatur oleh pompa
• Terjadi Kompetisi 2 fasa
• Dilakukan pada T rendah
• Elusinya pada tekanan tinggi (hingga 5000 psi atau 300
atm)
3 .Skema Alat HPLC
Peralatan HPLC
Fasa gerak (pelarut)
• Membutuhkan cukup banyak pelarut
• Sebelum pelarut digunakan dilakukan
degassing utk mengeluarkan gas terlarut yg
tdk diinginkan
• Adanya gas dlm pelarut dpt bereaksi dg fasa
gerak/fasa diam, dpt mengganggu krj detektor
• Fasa gerak harus bebas dari partikel debu krn
partikel2 kecil yg terbawa ke dalam pompa
atau masuk dlm kolom akan mempercepat
rusak pompa atau menyumbat kolom
• Fasa gerak disaring dg penyaring khusus yg
diameter porinya ± 0,45µm
Fase Gerak
Toluen 2,4
Aseton 5,1
Metanol 5,1
Asetonitril 5,8
Air 10,2
Sistem Pompa
Tekanan sampai 6000 psi
Kontrol aliran 0,1-10 mL/menit
HPLC: Berdasarkan komposisi fase gerak
Elusi gradien
% Solven B
Elusi Isokratik
Waktu (menit)
Elusi gradien
Apabila suatu campuran senyawa yang kompleks
ingin dianalisa yang terdiri dari komponen-komponen
yang mempunyai afinitas yang sangat berbeda, sering
didapatkan pemisahan yang tidak sempurna apabila
digunakan sistim isokratik
Untuk memecahkan persoalan ini komposisi fasa
gerak dapat diubah selama proses pemisahan sesuai
dengan tingkat affinitas masing-masing komponen
elusi gradien
Gradien elusi, dpt menggunakan lebih
dari dua pelarut yg secara otomatis dpt
diubah komposisinya sesuai
kebutuhan, sehingga diperoleh
pemisahan yg baik walau
menggunakan dua pompa
Gradient Analysis
Keuntungan:
Lebih baik untuk sampel campuran
Memiliki resolusi yang lebih baik
Kapasitas puncak lebih baik
Kerugian
HPLC yang lebih kompleks
Pengembangan Metode analisis dan implementasi
yang lebih rumit
Penyesuaian kolom dengan fase gerak membutuhkan
waktu sehingga analisis menjadi
Pengendali aliran(flow controller)
Si O
n
R2
Normal phase HPLC :
nonpolar solvent/polar colums.
Contoh R=hidrokarbon
Reversed phase HPLC :
polar solvent/nonpolar column.
Contoh R = cyano(C2H4CN)
diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH)
amino (C3H6NH2)
Detektor
Karakteristik detektor :
Tingginya sensitivitas yaitu lebih dari
0,1 µg sampel dlm 1 cm3
Tidak merusak sampel
Tidak sensitif thd perubahan
temperatur dan perubahan kecepatan
aliran fasa gerak
Detektor Fotometer (UV, IR,
Fluoresence)
• Detektor UV dikhususkan pada senyawa yg
memiliki serapan maksimum di daerah UV
yaitu senyawa yg memiliki elektron ikatan ᴨ
dan elektron non ikatan seperti olefin,
aromatik, dan senyawa yang mengandung
gugus –C=O, -C=S, -N=O dan –N=N-
• Detektor IR dapat dipakai untuk mendeteksi
beberapa panjang gelombang yg dapat diatur
menurut gugus fungsinya. Panjang gelombang
tersebut pada daerah 4000-690 cm-1
Detektor fluoresence dipakai untuk
senyawa yg memiliki tingkat selektifitas
tinggi pada senyawa yg berfluoresence.
Senyawa ini umumnya memiliki
struktur siklik konyugasi spt
polinuklear aromatik, asam amino
aromatik, phenol, quinolin
Detektor Refraktometer
Perbedaan detektor ini dari yg lain
adalah mampu memonitor perbedaan
indeks refraksi yg tdp dlm gasa gerak
dan fasa gerak-sampel ketika keluar
dari dalam kolom
Deteksi mampu dilakukan hingga
konsentrasi 1 ppm dlm larutan
Detektor Konduktometer
Didasarkan pd adanya perbedaan daya
hantar listrik dari larutan yg
melewatinya
Khusus digunakan utk mengukur
larutan elektrolit yaitu pd kromatografi
penukar ion
Fasa geraknya biasanya air atau
larutan buffer
Rekorder
Menggambarkan kromatogram
berdasarkan hasil yg diberikan oleh
detektor
Kolom HPLC
Kolom HPLC Berbagai ukuran
Teknik KCKT
- Pelarut
- Elusi dalam bentuk isokratik/gradien
- Kolom :
Silika Si–OH
Amino Si– (CH2)3 – NH2
Siano Si– (CH2)3 – CN
Diol Si– (CH2)2 – O – CH2 – CH – CH2
OH OH
RP-2 Si– (CH3)2
RP-8 Si– (CH2)7 – CH3
RP-18 Si– (CH2)7 – CH3
R R R R
HO Si OH Si O Si O Si
O O O OH O O
Si O Si O Si O Si O Si
PERMUKAAN SILIKA
MACAM FASA GUGUS R
SILIKA – OH
RP – 2 – CH2 – CH3
RP – 8 – (CH2)7 – CH3
RP – 18 – (CH2)17 – CH3
SIANO – (CH2)3 – C ≡ N
DIOL – (CH2)3 – O – CH2 – CH – CH2
I I
OH OH
HPLC Fase Normal
NP-HPLC: fase gerak non polar,
fase diam polar
Disebut juga kromatografi
adsorpsi (adsorption
chromatography)
Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit pada
fase diam polar (silika atau
alumina)
Analit polar lebih tertahan
daripada analit non polar karena
gugus silanol pada silika.
HPLC Fase terbalik
RP-HPLC: fase gerak polar, fase
diam non polar
Pemisahan didasarkan atas
koefisien partisi analit dalam
fase diam dan fase gerak
Urutan elusi: analit polar terelusi
lebih dahulu, analit non polar
terelusi terakhir
Untuk pemisahan analit non
polar (non ionik)
Untuk analit yang dapat
terionisasi (ionik) dapat
dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan pengaturan pH
fase gerak atau teknik pasangan
ion (ion-pair).
Ion Exchange HPLC
Restaurant FINISH
START
Chromatogram
tR-B
Respon Detektor
tR-A
Peak A Peak B
height
0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (menit) width
Area =
width x height
2
Waktu retensi kromatogram merupakan karakteristik suatu senyawa
tetapi tidak khas/ unik
Dari Kromatogram diketahui:
Data :
Kromatogram tR: waktu retensi (retention
time)
(parameter kualitatif)
tR-1
Respon Detektor
a b
Tailing Factor (USP)
Tailing Factor (Tf) = Symmetry Factor (As)
A = 2 dp
B/u = 2DM/u
CS = fS(k’)df2 / DS
CM = fM(k’)dp2 / DM