HPLC PREPARATIF

• Perbedaan dg kromatografi kolom lainnya

 Konsistensi dan ukuran partikel
 3 - 10 μm
Bentuk sferis
 Gunakan tekanan tinggi
 Pemilihan model
kromatografi
Fase normal
fase terbalik
gel permeation/size exclution chromatogaphy ion-exchange
chromatography
↓
tergantung

• Sifat fisika kimia senyawa

• Kompatibilitas dg fase diam
v
 Solven HPLC
• Tingkat kemurnian tinggi utk jaga integritas sistem dan
sampel
• Kompatibel dg detektor dan tidak mengganggu
pengamatan senyawa
• Kompatibel dg sampel  solubilitas dan nonreaktif
• Viskositas rendah
• Harga
 Degassed solvent
• Gelembung mengganggu detektor
• Cara :
 Menggunakan vakum
 Menaruh wadah solven di ultrasonic bath
 Sistem helium sparge
 Normal fase
Fase gerak :
•Hidrokarbon alifatik (n-heksana, n-heptana)
• Hidrokarbon terhalogenasi (kloroform, diklormetan)

• Hidrokarbon teroksigenasi (dietil eter, etil asetat,

aseton)
• Terhidroksilasi (isopropanol dan metanol)

Kandungan air harus dikontrol mendeaktivasi silika

 Fase terbalik
Fase gerak :
Campuran air dan pelarut organik, misal acetonitrile
(MeCN), MeOH, atau tetrahydrofuran (THF)
• Perlu pengontrolan pH (+asam, basa, bufer) utk

 Menekan ionisasi senyawa

 Kontrol derajat ionisasi gugus silanol bebas yg tdk
bereaksi untuk mengurangi peak tailing dan memperbaiki
sistem kromatografi
Interaksi silanol bebas pd RP-HPLC
Pengatasan :
• Penggunaan bufer
• meminimalkan variasi pH terlokalisasi akibat silanol
• berkompetisi deg senyawa yg terikat pd silanol
• End-capping dg reagen alkilsilil pendek oleh pabrik
• Menggunakan trietilamin pd eluen
Bufer
 Perhatian penggunaan buffer
• Jangan terjadi pengendapan dgn adanya
pelarut organik
• Garamnya harus dihilangkan dari produk
purifikasi akhir
Contoh pengaruh pH
 Detektor
• Detektor UV/Vis
• Detektor RI (refractive index)
 terbatas utk isokratik
 Penampungan fraksi
• Dasar :
• Waktu
 hasil fraksi banyak
 senyawa aktif belum diketahui
 fraksi tidak murni
• peak threshold
 peak yg telah melalui treshold ttt (misal
10% total dari respon detektor)
• peak gradient
 menghitung upslope dan downslope peak
 Perbaikan pemisahan
1. Ubah konsentrasi kosolven
• Pemisahan tdk sempurna
Isokratik  konsentrasi kosolven dirubah
gradien  waktu gradien
2. Pengubahan fase gerak
3. pH
4. Pertimbangan fase diam
• Fig. 7. Resolution of
cephalochromins by isocratic
HPLC. HPLC conditions: Column:
• Kromasi15 pm C8 15 x 0.46 cm.
Mobile phases:
• (A) 65% v/v acetonitrile/water.
• (B) 55% v/v acetonitrile/water.
• (C) 50% v/v acetonitrile/water.
• (D) 45% v/v acetonitrile/water.
• Flow rate: 1.5 mL/min.
• Detection wavelength: 2 10 nm.