Silfie Sabila

240210120121
V.

PEMBAHASAN
Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk

memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam

kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada
salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan
kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan
atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang
berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi
(terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas
yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak
(bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu yang
berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponenkomponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Cara kerja HPLC adalah pertama-tama fase gerak cair dialirkan melalui
kolom detektor dengan bantuan pompa. Cuplikan (sampel) dimasukkan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara
solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fasa diam, maka komponen tersebut akan keluar lebih lama. Setiap campuran
komponennya yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam
dalam bentuk kromatogram. Kromatogram HPLC serupa dengan kromatogram
kromatografi gas, dimana jumlah peak menyatakan jumlah komponen, sedangkan
luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer
digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta
mengolah data hasil pengukuran (Hendayana, 2006).
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya
(Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982;
Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Silfie Sabila
240210120121
Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
Rapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan "sample recovery"
Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan sekaligus
kualitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel
dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. sedangkan
untuk analisa kuantitatif dapat digunakan dengan persamaan :

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas:

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnyapolaritaspelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak
juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap
selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah
selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas.

Silfie Sabila
240210120121
Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang
kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritasyangluas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja
tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu
memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit
3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase
gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi
dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Posisi pada saat
memuat sampel

Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3
keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Silfie Sabila
240210120121

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya

jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase
diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen
seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang
rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih
sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril)
lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan.
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: oluter
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti oluter indeks bias dan oluter spektrometri massa;
dan golongan oluter yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti oluter UV-Vis, oluter fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu oluter harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: (1)
mempunyai respon terhadap olute yang cepat dan reprodusibel; (2) mempunyai

Silfie Sabila
240210120121
sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi olute pada kadar yang sangat
kecil; (3) stabil dalam pengopersiannya; (4) mempunyai sel volume yang kecil
sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita; (5) signal yang dihasilkan
berbanding lurus dengan konsentrasi olute pada kisaran yang luas (kisaran
dinamis linier); dan (6) tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir
fase gerak.
Sampel yang digunakan kali ini adalah kafein. Menurut depkes Ri (1995),
kelarutan yang dimiliki kafein adalah agak sukar larut dalam air, dalam etanol,
mudah larut dalam kloroform, sukar larut dalam eter. Preparasi sampel dalam
praktikum diawali dengan menimbang 1,25 gram sampel yang telah homogen,
kemudan ditambah 25 ml larutan pengekstrak dalam beaker glass. Campuran
larutan tersebut dipanaskan dengan waterbath pada suhu 70oC selama 40 menit,
lalu dinginkan dan saring di labu ukur 50 ml dan tambahkan larutan pengekstrak
hingga tanda batas. Sampel yang sudah diekstrak dimasukkan ke dalam botol vial
tertutup, kemudian siap untuk dianalisis dengan HPLC.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu
retensinya akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncakpuncaknya terpisah. Dari analisis standar yang dilakukan, didapatkan bahwa
konsentrasi standar adalah 100 ppm (100 mg/kg). Luas permukaan standar kafein
adalah 1649943, dengan waktu retensi 5,102 menit. Terdapat dua sampel yang
diujikan, yaitu sampel 1 dan sampel 2. Sampel 1 memiliki waktu retensi 5,041
menit dengan luas permukaan 856830. Sedangkan sampel 2 memiliki waktu
retensi 5,063 menit, dengan luas permukaan 805063. Kita dapat menghitung
kosentrasi kafein yang terdapat pada sampel dengan menggunakan rumus :

Berikut merupakan perhitungan untuk sampel 1 :

sehingga didapat C sampel adalah 51,93 ppm
Berikut merupakan perhitungan untuk sampel 2:

Silfie Sabila
240210120121

sehingga didapat C sampel adalah 48,79 ppm.

Metode yang terjadi selama proses HPLC dapat dilihat pada gambar di
bawah ini.

Gambar 1. Skema proses HPLC

(Sumber : www.noviechemist.blogspot.com)
Berdasarkan skema di atas, standar dan sampel yang telah diekstrak
dimasukkan ke dalam botol vial tertutup dan dimasukkan ke dalam tempat untuk
injeksi sampel. Pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom ke detektor dengan
bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam aliran fasa gerak dengan
cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa
diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar
dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang interaksinya kuat dengan
fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen yang campuran
yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram (Hendayana, 2006).

Silfie Sabila
240210120121

VI.

KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum yang dilakukan, kesimpulan yang didapat adalah:

1. Konsentrasi Sampel 1 adalah 51,93 ppm

2. Konsentrasi Sampel 2 adalah 48,79 ppm

Silfie Sabila
240210120121

DAFTAR PUSTAKA
Anonim.1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.
Husein H, Bahti. 1998. Teknik Pemisahan Kimia dan Fisaka
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan
Elektroforensis Modern. PT Remaja Rosdakarya, Bandung
Snyder, L.R. dkk. 1979. Introduction to Modern Liquid Chromatography. New
York : John Wiley & Sons