High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

1.  Pengertian HPLC
Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography,
HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai
dengan tekanan tinggi. HPLC digunakan untuk memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan
merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini
sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan
bantuan detector serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatogram
memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

2. JENIS- JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya
kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan
ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase
terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase
diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC
sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan
alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol
pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara
kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi
atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan
fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-
alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik
dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel
ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih
dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul
yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati
porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam
seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
 Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.

3.  Beberapa kegunaan dari HPLC :

·         HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
·         Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
·         Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
·         Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
·         Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
·         Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
·         Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

4. Aplikasi dalam ilmiah

Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode
HPLC denaturing (DHPLC). This procedure can separate double-stranded DNA
molecules that differ by as little as one . Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA
untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan basa .The speed of analysis
(approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that can be
analyzed (up to 2.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of
applications in the field of molecular biology. Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per
sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2,0 kilobyte) telah
membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang
biologi molekuler.Applications of DHPLC include the detection of single
nucleotide (SNPs). Aplikasi DHPLC termasuk deteksi tunggal
nukleotida polimorfisme (SNP). These are single base-pair variations in DNA that can
give valuable information on genetic variation within a population. Ini adalah satu
dasar pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang
variasi genetik dalam suatu populasi,  They can also help to identify the genes that cause
certain human diseases.dan  juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang
menyebabkan penyakit manusia tertentu. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC
adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis.
Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:
·         Analisis Diazepam dalam darah
Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Senyawa ini
berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air, rumus kimiaC23H27N.
Diazepam termasuk obat  antiansietas, antikonvulsan, dan sedatif. Mempunyai Indikasi
untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi akibat keracunan, kejang
demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan
mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Kemudian
sampel yang sudah melalui proses  preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC.
 5. Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut
merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:
·         Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah
yang tinggi.
·         Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
·         Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
·         Kolom dapat digunakan kembali.
·         Waktu analisa cukup singkat.
·         HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.
·         Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
·         Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:

·         Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
·         Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
·         Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali
dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

6. Prinsip kerja
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC
memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga
keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.
Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat
sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan
yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan
menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.
  

Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya dilakukan secara otomatis sehingga tidak bisa mengetahui
yang terjadi pada keadaan tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama
halnya dengan kromatografi gas.

Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi.Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari
senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda pula. Untuk
beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
·         tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
·         kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
·         komposisi yang tepat dari pelarut
·         temperatur pada kolom
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode
umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-
violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang
gelombang

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang
melewati melalui berkas pada waktu itu

Interpretasi output dari detektor

 Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor,
dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung
sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).

 
7. Perawatan HPLC
Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom,
namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum,  kolom yang sering
digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat permukaan
fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai pelarut organik.

Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara efisien.
·         Stabilitas pH
kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika mengukur nilai pH,
pengukuran harus dilakukan dalam media air sebelum mencampur eluen dengan pelarut
organik. HPLC kolom dapat digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang
memungkinkan penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner
didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada rentang pH yang lebih
tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada sifat kimia pengubah yang digunakan
dalam fase gerak. Basis Besar (seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan
silika dan oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
·         Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat
stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas tekanan, dan dapat
digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi) tanpa masalah. Tekanan menyebabkan
guncangan penyaluran dalam kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada
kromatogram
·           Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi ireversibel dari
kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs adsorpsi, mengubah
selektivitas kolom dan mengarah ke puncak memisahkan di kromatogram tersebut.
·           Penyimpanan Kolom
v  Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat disimpan dalam eluen yang digunakan
dalam terakhir analisis.
v  Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama akhir pekan, kolom harus
dibilas dengan air yang murni untuk mencegah pertumbuhan mikroba.
v  Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut harus dapat disimpan dalam
pelarut aprotik. Kandungan air tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah
pelarut Asetonitril.