Venitha Dwi Hertanti

240210120028
IV.

PEMBAHASAN
Kromatografi adalah suatu proses migrasi diferensial dalam komponen-

komponen sampel ditahan secara selektif oleh fase diam. Kromatografi

dilaksanakan dalam situasi dinamik, jadi salah satu dari kesua fase di atas
merupakan fase bergerak (mobile phase) dan lainnya merupakan fase diam
(stationary phase). Fase bergerak dapat berupa cairan atau gas, sedang fase diam
dapat berupa cairan atau padatan.
Semua jenis kromatografi , zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi
sepanjang kolom dan yang menjadi dasar pemisahan terletak dalam laju
perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda. Laju perpindahan sebuah
zat terlatut dapat dianggap sebagai hasil dari dua faktor. Perbedaan yang kecil
antara dua zat terlarut dalam kekuatan adsorpsi dan dalam interaksinya dengan
pelarut yang bergerak menjadi dasar pemisahan bila molekul-molekul zat terlarut
itu berulang kali menyebar di antara dua fasa itu ke seluruh kolom (R.A. Day,
et.all, 2002).
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan
ataucairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas).
Fasegerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari
campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada
laju yang berbeda pula.
Kromatografi cair

kinerja

tinggi

(high

performance

liquid

chromatography, HPLC) adalah bentuk kromatografi kolom sering digunakan

dalam biokimia dan kimia analitik untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
menghitung senyawa berdasarkan polaritas istimewa mereka dan interaksi dengan
yang kolom fase stasioner. HPLC ini biasanya untuk bahan yang bersifat nonvolatil atau bahan organik.
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah
memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi
(kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen
tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi
tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa
kuantitatif bertujuan untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut
dalam sample. Analisis kuantitatif harus memperhatikan :
Parameter percobaan sama antara standar dan sampel.

Venitha Dwi Hertanti

240210120028
Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama.
Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area
puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan
standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat
bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan
dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
HPLC ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan dengan
tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam, tergantung
mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. Untuk menentukan fase
geraknya yang perlu diperhatikan adalah polar atau non-polarnya larutannya.
Untuk fase gerak pada 2 eluen yang berisi aquades dan etanol. Sedangkan untuk
fase diamnya yaitu pompa. Pompa terbagi atas pompa A dan pompa B yang
berfungsi untuk memompa dan masuk kedalam kolom (C18). Fase diam ini
terdapat silika. Pemisahan pada HPLC ini berdasarkan kepolarannya.
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak,
dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam
campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.

Gambar 5. Output HPLC

Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas
untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah
bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industriindustri makanan. Kegunaan umum HPLC adalah untuk: pemisahan sejumlah
senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian

Venitha Dwi Hertanti

240210120028
(impurities); analisis senyawa- senyawa mudah menguap (volatile); penentuan
molekul- molekul netral, ionic, maupun zwitter ion; isolasi dan pemurnian
senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hamper sama; pemisahan
senyawa- senyawa dengan jumlah sekelumit (trace elements), dalam jumlah yang
banyak, dan dalam skala proses industry, HPLC merupakan metode yang tidak
destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif
(Cupritabu, 2010). Menurut Khopkar (1990), zat dengan kepolaran berbeda dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif
pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk degradasi
dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk identifikasi
senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer massa (MS).
Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka resolusi yang baik
sulit diperoleh
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase
normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam
silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai
silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang
akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
2. Kromatografi Fase Terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi
secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi

Venitha Dwi Hertanti

240210120028
silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air
atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi Penukar Ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren
resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau
kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion
sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
4. Kromatografi Pasangan Ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode
penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang
berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih

Venitha Dwi Hertanti

240210120028
besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara
partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran
ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi
yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya
dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan
sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara
antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi
protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
Keunggulan Dan Kelemahan HPLC
a) Kelebihan HPLC
HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan

zat yang tidak stabiL

HPLC memiliki detektor dengan kepekaan yang tinggi
Memiliki daya memisah yang tinggi
Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya
Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya
dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat

kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)

Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan

Chromatography) kuno, sehingga dapat menurunkan biaya karyawan

Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar
HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri

farmasi dan pestisida.

Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar

dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.

Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang

dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.

LC

(Liquid

Venitha Dwi Hertanti

240210120028
Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
b) Kekurangan HPLC
Preparasi sampel yang lebih rumit karena sampel yang disiapkan saat
diinjeksikan ke HPLC harus sudah cukup bersih dari impurities agar

kromatogram tidak menumpuk.

Kesulitan biasanya dihadapi

ketika

akan

mengidentifikasi

suatu

kromatogram yang terdiri atas banyak peak.

Contoh penggunaan HPLC yaitu mengukur vitamin B pada sampel yang
digunakan adalah minuman berenergi yang mengandung banyak vitamin B.
Berdasarkan tujuan dari minuman tersebut maka terdapat beberapa vitamin di
dalamnya, seperti vitamin B1, B2 dan B6.
Preparasi sampel dilakukan kemudian melakukan programming alat dan
conditioning alat, hal ini bertujuan untuk menghasilkan chromatogram yang baik
ketika sampel dan standar diinjeksikan. Programing alat dilakukan dengan
mengatur detector yang digunakan, panjang gelombang dari sampel yang akan
diinjeksikan, letak tray sampel, pompa yang digunakan serta flow rate atau laju
alir dari fase gerak tersebut. Condiitoning alat bisa dilakukan dengan mengalirkan
fase gerak yang digunakan pada program yang telah diatur selama 30 menit.
Setelah semuanya siap, standar diinjeksikan sebanyak 5-6 kali lalu diikuti
dengan injeksi sampel. Hasil yang keluar berupa peak/puncak yang dapat dilihat
luas areanya serta retention time. Retention time dari sampel dibandingkan dengan
retention time standar, jika peak yang muncul diwaktu yang sama dengan peak
pada standar maka sampel tersebut positif mengandung bahan yang sama dengan
standar. Retention time juga menunjukkan kepolaran suatu sampel, jika retention
time pendek maka sampel tersebut paling polar sedangkan retention time yang
lama menandakan bahwa sampel tersebut semakin tidak polar. Sedangkan luas
area menandakan konsentrasi dari sampel yang diinjeksikan. Berikut contoh hasil
penggunaan HPLC.
Tabel 1. Standar
Name

RT

Area

Height

Mount

Units

Vit B2

2.099

785823

140200

3.450

mg/ml

Vit B6

5.771

7112815

675582

20.080

mg/ml

Venitha Dwi Hertanti

240210120028
3

Vit B1

15.155

3300462

113383

26.600

mg/ml

Area

Height

Mount

Units

1609555

159816

4.544

mg/ml

Sumber : (Data Pribadi, 2014)

Tabel 2. Hemaviton C 1000
Name
RT
1

Vit B2

2.099

Vit B6

5.647

Vit B1

15.155

Sumber : (Data Pribadi, 2014)

Perhitungan =

=
= 4.544
Penimbangan sampel = 1.259 gram = 1259 mgram = 1259 mgram/50 ml
= 1290

Vit B6 =

= 25.18 mgram / ml

= 18.043%

Pada industri pangan, pengaplikasiaan alat HPLC sering digunakan untuk

mengetahui kadar trigliserida minyak dan lemak. Aplikasi lain penggunaan HPLC
pada analisa pangan sangat beragam, seperti untuk karbohidrat, HPLC bisa
digunakan untuk gula dengan titik leleh rendah serta oligosakarida. Penentuan
secara kuantitatif karbohidrat dalam bahan pangan dengan HPLC juga sudah
menjadi standar baku. Untuk lipid yang kompleks, yang memiliki volatilitas
rendah serta yang struktur kimianya sensitif terhadap suhu tinggi, HPLC juga
menjadi pilihan terbaik. Kemudian, HPLC juga dapat digunakan penentuan kadar
vitamin dalam bahan pangan. Selain itu, yang juga banyak dilakukan adalah
penggunaan HPLC untuk melihat komposisi asam amino dalam protein.

Venitha Dwi Hertanti

240210120028

DAFTAR PUSTAKA
Day, R.A. dan A. L. Underwood. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Penerbit
Erlangga, Jakarta.
Sudarmadji, S., B. Haryono, dan Suhardi. 1989. Analisa Bahan Makanan dan
Pertanian. Penerbit Liberty, Yogyakarta.
Winarno, F.G.. 1991. Kimia Pangan dan Gizi. Penerbit PT. Gramedia Pustaka
Utama, Jakarta.