STAK CILEGON

Holisha Widiyanto, S.Si, M.T

HPLC
(High Performance Liquid Chromatograhpy)
 Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga
disebut dengan High Performance Liquid Chromatography
(HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat
digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Ini
merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair
yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti Teknik
kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk
HPLC memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya
terhadap zat padat tertentu. KCKT paling sering digunakan
untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti
asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein
dalam cairan fisiologis, menetukan kadar senyawa-senyawa
aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau
produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi
 1. Kromatografi Adsorbsi
2. Kromatografi Fase Terikat
JENIS – 3. Kromatografi Penukar Ion

JENIS HPLC 4.
5.
Kromatografi Pasangan Ion
Kromatografi Eksklusi ukuran
6. Kromatografi Afinitas
 Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui
sebagaimana dalam kromatografikolom dan

KROMATO
kromatografi lapis tipis.Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanyamenggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan

GRAFI alumina,meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini

memakai silika sebagai fase diamnya.Pada silika dan alumina

ADSORBSI terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan

solut.Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapatterikat secara kuat sehingga
dapat menyebabkan puncak yang berekor
KROMATOGRAFI FASE
TERIKAT
 Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secarakimiawi atau fase
terikat.Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalahhidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti
dengan oktadesilsilana, oktasilana, ataudengan fenil.Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan
(ODS atauC18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

 Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau denganlarutan bufer. Untuk solut yang

bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangatkrusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan
mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fasediam
menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidakterionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat
  KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang

dapat menukar kation atau aniondengan suatu fase

gerak.Ada banyak penukar ion yang beredar di
pasaran, meskipundemikian yang paling luas

KROMATO penggunaannya adalah polistiren

Kebanyakanpemisahan kromatografi ion dilakukan
resin.

GRAFI dengan menggunakan media air karena

sifationisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut

PENUKAR campuran misalnya air-alkohol danjuga

organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak
pelarut

ION air, retensi puncakdipengaruhi oleh kadar garam

total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase
gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak
menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkanoleh
penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan
ion fase gerak untuk guguspenukar ion pada resin
KROMATO  Kromatografi pasangan ion juga dapat

GRAFI
digunakan untuk pemisahan sampel-
sampelionik dan mengatasi masalah-masalah

PASANGA yang melekat pada metode penukaran

ion.Sampelionik ditutup dengan ion yang
N ION mempunyai muatan yang berlawanan.
KROMATOGRAFI EKSKLUSI
UKURAN
 Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapatdigunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000dalton. Fase diam yang digunakan
dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara
partikel), atau berdifusi lewat fasediam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan
terelusi terlebihdahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah
molekulyang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewatiporus,
akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalampemisahan dengan
eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fasediam seperti tipe kromatografi yang
lain.
  Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-
interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam

KROMATO mengandung gugus-gugus molekul yang

dapatmenyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang
hanya

GRAFI terkait dengan muatan dan steriktertentu pada sampel

yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara

AFINITAS
antigen dan antibodi).

 Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi

protein (enzim) daricampuran yang sangat komplek

 Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi
adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa
konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut
(kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui
informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu
sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui
jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample.

PRINSIP
DASAR HPLC Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair
yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan
maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan
Teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area
puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan
luas atau area larutan standar. Pada prakteknya,
perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila
hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka
perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva
kalibrasi (Cupritabu, 2010)
 SKEMA
PRINSIP
KERJA
Cara kerja dari alat HPLC adalah dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom kedetector.
Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap
HPLC
fasa diam. Solut solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.
Sebaliknya, solut solut yang kuat berinteraksi berinteraksi dengan fasa diam maka solute solute tersebut
akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector
kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
 Fase gerak (eluen) 

Pompa 
KOMPONEN –
KOMPONEN Injektor 
HPLC
Kolom 

Detektor 
FASE GERAK (ELUEN)
 berupa zat cair. Fase gerak selain sebagai pembawa senyawa campuran menuju detektor, fase gerak juga dapat berinteraksi dengan
solut-solut. Beberapa persyaratan HPLC antara lain :
1. Harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan dianalisis
2. Zat cair harus murni dan jernih untuk menghindari kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatogram dan menghindarkan
penyumbatan kolom
3. Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
4. Memiliki viskositas rendah. Umumnya tidak melebihi 0.5 cP (Centi Poise)
5. Sesuai dengan detektor yang digunakan

 Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak:
 HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti
silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskanpada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau
i-propileter.
 HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa gerakpolar. Fasa gerak yang digunakan seperti
air, methanol, atau asetinitril
 Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada
manusia yang berfungsi untukmengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus.Persyaratan pompa yang digunakan
dalam HPLC:
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit4. Bahan tahan
korosi
POMPA Tiga Jenis Pompa yang digunakan dalam HPLC :
1. Pompa Reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa
dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor
2. Pompa Displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor
3. Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi
 merupakan tempat masuknya sampel. Sampel yang dimasukkan ke
dalam HPLC hanya beberapa puluh mikroliter. adakalanya injektor
merupakan suatu sistem autosampler.

Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala

INJEKTOR kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada
kemasan kolom. Ada 3 macam system injector, yaitu:

Loop vaive : tipe injector ini

Septum : septum yang
umumnya digunakan untuk
digunakan pada KCKT sama
menginjeksi volume lebih
dengan yang digunakan
Stop flow : aliran dihentikan, besardari 10µ dan dilakukan
padakromatografi gas. Injector ini
injeksi dilakukan pada kinerja dengan cara automatis (dengan
dapat digunakan pada kinerja
atmosfir, system tertutup danaliran menggunakan adaptor yang
sampa 60 – 70 atmosfir.
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa sesuai,volume yang lebih kecil
Tapiseptum ini tidak tahan dengan
digunakan karena difusi di dalam dapat diinjeksikan secara manual).
semua pelarut-pelarut
cairan kecil danresolusi tidak Pada posisi load, sampel
kromatografi cair. Partikel kecil
dipengaruhi. diisikanke dalam loop pada
dariseptum yang terkoyak (akibat
kinerja atmosfir, bila valve
jarum injector) dapat
difungsikan, maka sampel akan
menyebabkan penyumbatan.
masuk dalamkolom
KOLOM
 HPLC berisi fase diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-
komponennya yang kemudian dapat dihitung waktu retensi masing – masing komponennya
oleh detector. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel
untuk melewati kolom menuju detektor. Waktu retensi dihitung dari saat sampel diinjeksikan
hingga puncak pembacaan maksimum pada detektor. Senyawa yang berbeda akan memiliki
waktu yang berbeda sehingga masing-masing konsentrasinya dapat dihitung . Biasanya kolom
berukuran antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar antara 4-10 mm. Jenis kolom bervariasi
bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penukar ion. Yang
paling banyak dipakai adalah kolom C-8 dan C-18. Saat ini yang baru diperkenalkan adalah
kolom HILIC (Hidrophilic Interactive Liquid Chromatography)
  Alat ini berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang telah melewati

kolom dan memberikan sinyal elektronik pada pengolah data. Terdapat

beberapa jenis detektor HPLC tergantung dari karakteristik yang hendak dibaca.
Misalnya pada detektor jenis UV-vis, maka karakteristik yang dibaca oleh

DETEKT
detektor adalah absorbansinya. Detektor jenis lain yang bisa digunakan adalah
detektor indeks bias, fluoresensi, serta detektor elektrokimia.

Jenis – Jenis Detector :

OR
 UV/Vis
 Retraktif indeks (RI) detector
 Konduktifitas decetor
 Elektroimia detector
 PDA (Photodiode - Array
 ELSD (Evaporative Light – Scattering Detector)
 MS dectetor
KEUNTUNGAN
MENGGUNAKAN HPLC
Dapat menganalisis Interaksi yang lebih
sampel yang tidak selektif dengan molekul
Berbagai jenis kolom yang Menghasilkan pemisahan
mudah menguap atau sample kerena fasa gerak
selektif. dengan kecepatan tinggi.
tidak stabil dan fasa diamberperan
denganpemanasan. dalam proses kromatografi.

Pemasukan sample yang Keragaman kolom dan

tepat dan mudah Resiko peruraian sample detector berarti bahwa
Waktu analisis yang cepat. dikendalikan sehingga yang lebih kecil karena tidak selektivitas metode
menjamin dilakukan pemanasan. tersebut dapatdisesuaikan
presisikuantitatif. dengan mudah
  Keterbatasan HPLC adalah untuk
identifikasi senyawa, kecuali jika HPL

KEKURAN dihubungkan dengan spektrofotometer

massa (MS). Selain itu, keterbatasan
GAN HPLC lainnya adalah jika sample dianalisis
sangat kompleks, maka resolusi yang baik
sulit diperoleh.
CONTO
H HASIL
ANALIS
A HPLC