Kel

HPLC/KCKT Kelompok 2:
Emilda yaman
Eunike napitupulu
Eva yusriani
Evi susanti
Fajri hidayat
Feri kasman
Nani sugianti
Mukminatin
Miranti utami
Mili kasyani
Meftia reny
 Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC (Hight
Performance Liquid Chromatograhy ) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun
1970-an. Saat ini KCKT merupakan tekhnik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis
dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam sebidang, antara lain : farmasi,
lingkungan, bioteknologi, polimer dan industri-industri makanan.

High performance liquid chromatography (HPLC) adalah suatu alat teknologi kimia modern yang
digunakan untuk menentukan komponen dalam suatu sampel dengan metode pememisahkan
komponen berdasarkan interaksi antara fase gerak dan fase diam (McMaster 2007). Pengertian
lain dari HPLC yaitu Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid
chromatography) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zatcair yang biasanya disertai
dengan tekanan tinggi.
 Klasifikasi berdasarkan mekanisme

01 02
Kromatografi adsorpsi/ fase normal
(adsorption chromatography) Kromatografi fase terbalik

03
Kromatografi Pertukaran ion
(ion exchange Chromatography)
04
Size Exclusion Chromatography
(SEC)
Kromatografi Permeasi Gel;
Kromatografi Filtrasi Gel
 1. Kromatografi adsorpsi/ fase normal
(adsorption chromatography)

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan

kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase

normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar

90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina

terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika

mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga

dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terbalik

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat.
Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti
dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut
yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak
diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies
yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian
yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena
sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan
juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak
dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan
kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan
kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.
 4. Kromatografi Permeasi Gel

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul
yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan
solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam.
Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia
antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
 Contoh analisis menggunakan
kromatrografi HPLC

Analisis Diazepam dalam darah Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan

psikotropika. Senyawa ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air,
rumus kimiaC23H27N. Diazepam termasuk obat antiansietas, antikonvulsan, dan
sedatif. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus, ansietas atau insomnia, konvulsi
akibat keracunan, kejang demam, dan sebagai obat penenang. Prinsip cara uji diazepam
ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang
sesuai. Kemudian sampel yang sudah melalui proses preparasi

Struktur Kimiawi Diazepam

Berikut adalah bagian-bagian dari
alat HPLC secara umum.
01 Fase gerak

Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen
atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen
campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi
dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan
salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
 Persyaratan fasa gerak HPLC:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector
 02 Pompa

Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang
berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi
serbuk halus.
Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC:
1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2)
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit
4. Bahan tahan korosi
.
 03 alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi)

Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC:

1. Injeksi syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi.
akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek.
2. Injeksi ‘stop-flow’
Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung
kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali
kolom maka pelarut dialirkan kembali.
3. Kran cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua
langkah:
a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”, cuplikan masih berada dalam loop
b) Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi “injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam
kolom.
 04 Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan
solut/analit.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang
tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi
secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan
bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
05 Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:

1. detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks
bias dan detektor spektrometri massa.
2. golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.
 Prinsip kerja HPLC

Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke

detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut
terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut
yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut
akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang
keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram.
 Kelebihan & Kekurangan HPLC
Kelebihan dari HPLC yaitu :
● • Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.
● • Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
● • Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
● • Kolom dapat digunakan kembali.
● • Waktu analisa cukup singkat.
● • HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
● • kecil kuantitasnya.
● • Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kekurangan dari HPLC yaitu :

● • Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
● • Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
● • Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel
lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
 Pembahasan Jurnal
Judul : Identifikasi Asam Dehidroasetat dalam Produk Kosmetika dengan Menggunakan HPLC
(High Performance Liquid Cromatography)

Pendahuluan: Kosmetik menjadi kebutuhan manusia khususnya kaum perempuan yang tidak bisa
dipandang dengan sebelah mata lagi, semakin terasa bahwa kebutuhan terhadap kosmetik yang
beraneka bentuk dengan ragam warna dan keunikan kemasan, serta keunggulan dalam memberikan
fungsi bagi konsumen, hal tersebut menuntut industri kosmetik untuk terus mengembangkan
teknologi yang tidak saja mencakup kemasan dari kosmetik itu sendiri namun juga cara
menggunakannya. Penggunaan kosmetik harus disesuaikan dengan aturan pakai yang telah tercantum
di balik kemasan, misalnya harus sesuai jenis kulit, iklim, cuaca, waktu penggunaan, umur, dan
jumlah pemakaiannya sehingga tidak menimbulkan efek yang tidak diinginkan (Pangaribuan, 2017).
Banyaknya kosmetik yang beredar dipasaran dengan kandungan kimia tertentu didalamnya membuat
pengguna merasa harus lebih berhati-hati dalam memilih kosmetik yang aman. Penambahan bahan
kimia dalam kosmetik bertujuan antara lain sebagai pengawet. Dengan adanya pengawet diharapkan
produk kosmetik tersebut bisa digunakan dalam jangka waktu yang lama.
● Menurut Permenkes RI No.445/MENKES/ PER / V/1998 adalah zat yang dapat mencegah
kerusakan kosmetika yang disebabkan oleh mikroorganisme. Dengan ini diharapkan bahan
pengawet yang digunakan dalam kosmetik haruslah bahan yang tidak aktif sehingga tidak
menyebabkan iritasi pada kulit. Salah satu bahan kimia yang digunakan sebagai pengawet
adalah Asam Dehidroasetat.

● Asam Dehidroasetat merupakan senyawa asam organik yang memiliki beberapa aplikasi
industri yang memiliki sifat tidak berbau, berwarna putih, hampir tidak larut dalam air dan
cukup larut dalam kebanyakan pelarut organik. Asam Dehidroasetat banyak digunakan dalam
kosmetik pembersih wajah sebagai bahan pengawet. Kosmetik jenis pembersih wajah
digunakan untuk mengangkat kotoran pada wajah yang larut dalam minyak dan tidak larut
dalam air, seperti make-up dan polusi
Metode :
Alat yang digunakan untuk proses analisis antara lain; seperangkat alat KCKT, kolom
oktadesilsilana (C18) (4,6x 250mm) ukuran partikel 5μm, penyaringan membrane ukuran 0,45μm,
detektor UV.
Larutan uji dibuat dengan melarutkan 0,5 sampel didalam gelas kimia sebanyak 0,5 gram dengan
5 ml metanol. larutan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml (larutan a). Selanjutnya disonikasi
selama 10 menit. Lrutan disaring dengan kertas saring . Diambil sebanyak 1,0 ml filtrat larutan a
dan diencerkan dengan10 ml metanol. Selanjutnya disaring dengan penyaringan membran
berukuran 0,45 μm (larutan A).
Larutan baku dibuat dengan melarutkan 10 mg asam Dehidroasetat BP dengan10 ml metanol
dalam labu ukur 10 ml (larutan b1). Diambil 1,0 ml larutan b1 kemudian diencerkan dengan 10 ml
metanol (larutan b2). Diambil 1,0 mlLarutan b2 diencerkan dengan 10 ml metanol (larutan b3).
Selanjutnya diambil 1,0 ml larutan b3 diencerkan dengan 10 ml metanol (larutan B).
Hasil Penelitian:
Salah satunya produk pembersih wajah bermerek merupakan produk perawatan wajah yang
paling sering digunakan. Tak hanya sekadar untuk mengangkat kotoran di wajah tapi juga
sebagai penambah kecantikan.
Didalam pengujian ini sampel dilakukan preparasi sampel dan dilakukan sonikasi sebelum
dilakukan HPLC. Sonikasi bertujuan agar tercampurnya dengan sempurna suatu larutan
sehingga memiliki kandungan zat yang homogen, baik kadar zat maupun warna dalam
bentuk fisik dan memecah senyawa atau sel untuk pemeriksaan lebih lanjut.
Dari hasil pengujian yang dilakukan pada uji baku Asam Dehidroasetat dapat dilihat
Kromatogram Baku diperoleh peak pada retention time (RT) 11.583 menit Sedangkan uji
sampel pembersih wajah Kromatogram sampel dapat dilihat tidak adanya peak pada
kromatogram.

Kesimpulan: Berdasarkan analisis data dari Asam Dehidroasetat terhadap kosmetik

pembersih wajah di BBPOM di medan dapat disimpulkan bahwa sampel kosmetik
pembersih wajah tidak mengandung Asam Dehidroasetat.
TERIMAKASIH