PERCOBAAN 7

PENENTUAN KADAR PROTEIN TOTAL

(METODE KJELDAHL)
I. Tujuan

Memahami metode Kjeldahl untuk penentuan kadar protei total.

II. Prinsip

Berdasarkan reaksi oksidasi dari sampel oleh H2SO4 dengan menggunakan

katalisator (misalnya: campuran pereaksi Selenium) sehingga protein dan asam

amino menjadi (NH4)2SO4

III. Teori dasar

Protein berasal dari bahasa Yunani protos, yang berarti “yang paling utama”.

Protein merupakan senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang

merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu

sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung komposisi rata-

rata unsur kimia yaitu karbon 50%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 26%,

dan kadang kala sulfur 0-3% serta fosfor 0-3%. Protein merupakan komponen

utama sel hewan dan manusia. Proses kimia dalam tubuh dapat berlangsung

dengan baik karena adanya enzim, suatu protein yang berfungsi sebagai

biokatalisator. Disamping itu hemoglobin dalam butir-butir darah atau eritrosit

yang berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru ke seluruh bagian

tubuh, adalah salah satu jenis protein. Terdapat ikatan kimia lain dalam protein

yaitu ikatan hidrogen, ikatan hidrofob, ikatan ion/ikatan elektrostatik, dan ikatan

Van Der Waals. Protein dapat tidak stabil terhadap beberapa faktor yaitu pH,

radiasi, suhu, medium pelarut organik, dan detergen.

Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup dan

merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua sel

dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda

dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri

yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari

rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen

dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai

samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu,

kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur

protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam

amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein

yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini

organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian

bervariasi, seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring

laba-laba, dan sebagainya (Lehninger, 1982).

Secara kimiawi, protein merupakan senyawa polimer yang tersusun atas asam-

asam amino sebagai monomernya. Protein adalah suatu polipeptida yang

memiliki lebih dari 100 residu asam amino. Protein alamiah memiliki 20 jenis

asam amino. Untuk setiap protein tertentu, urutan dan jenis-jenis asam amino

yang menyusun sangat spesifik. Suatu protein yang hanya tersusun atas asam

amino dan tidak mengandung gugus kimia lain disebut protein sederhana.

Contohnya enzim ribonuklease dan khimotripsinogen. Namun, banyak protein

yang mengandung bahan lain selain asam amino seperti derivat vitamin, lipid,
atau karbohidrat, protein ini disebut protein konjugasi. Bagian yang bukan asam

amino dari jenis protein disebut gugus prostetik. Contohnya lipoprotein

mengandung lipid dan glikolipid mengandung gula.

Protein merupakan makromolekul (BM besar 5000-1.000.000) yang umumnya

terdiri dari 20 macam asam amino. Protein merupakan polimer yang terdiri dari

satu asam amino yang terikat secara kovalen.

Asam amino berikatan secara kovalen satu dengan yang lain dalam variasi

urutan bermacam-macam, membentuk rantai polipeptida. Ikatan antara asam

amino disebut ikatan peptide.

Ikatan peptide adalah ikatan antara gugus α-karboksil dari asam amino 1 dengan

gugus α-amino dari asam amino lain.

Dalam struktur protein terdapat ikatan kimia lain diantaranya ikatan hidrogen,

ikatan hidrofob, ikatan ion/ikatan elektrostatik, ikatan van der Waals dan Ikatan

sulfhidril. Struktur tidak stabil terhadap beberapa faktor seperti pH, radiasi,

suhu, medium pelarut organic dan detergen. Protein umumnya reaktif dan sangat

spesifik karena terdapat gugus samping yang reaktif (dapat berupa kation, anion,

hidroksil aromatik, hidroksil alifatik, amin, amida, tiol, heterosiklik) dan

memiliki susunan khas struktur maromolekul.

Uji kuantitatif dapat dilakukan untuk mengetahui jumlah kandungan protein

dalam suatu bahan salah satunya metode Kjeldahl. Metode Kjeldahl dugunakan

untuk menentukan kadar protein total, biasanya diaplikasikan pada makanan.

Dengan metode ini dapat dihitung kadar protein kasar (crude protein) karena

yang dihitung adalah total N, sehingga akan ikut terhitung senyawa lain yang

mengandung N namunbukan merupakan protein.

Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen

total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel

didestruksi dengan H2SO4 dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai

sehingga akan menghasilkan (NH4)2SO4. Setelah pembebasan dengan alkali/basa

kuat, ammonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan

penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak mengalami
modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya

memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang

pendek.

Analisis protein dengan metode Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi

tiga tahap, yaitu proses destruksi, destilasi dan titrasi.

1. Proses destruksi Pada tahap ini, sampel dipanaskan dalam H 2SO4 pekat

sehingga terjadi penguraian sampel menjadi unsur-unsurny. Elemen karbon,

hydrogen teroksidasi menjadi CO, CO 2 dan H2O. Sedangkan nitrogen akan

berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi

ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 (Sodium sulfate) dan

HgO (Merkuri oksida) 20 : 1. Gunning mengajurkan menggunakan K 2SO4

(Kalium sulfat) atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut titik

didih H2SO4 akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain

katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan

Selenium (Se) yang dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut

selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi

tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya.

N organik + H 2 SO4 →(NH 4 )2 SO 4 + H 2 O+CO 2 +hasil lain

2. Proses destilasi Pada tahap ini sampel dipanaskan dalam H2SO4 dipecah

menjadi (NH4)2SO4 dengan penambahan NaOH sampai akalis dan

dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun

pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat

ditambahkan logam zink (Zn). Ammonium yang dibebaskan selanjutnya

 akan ditangkap oleh HCl atau H3BO3 4 % dalam jumlah yang berlebiha.

Agar kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung

tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui

asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indicator misalnya BCG – MR

(campuran brom cresol green dan methyl red) atau PP (phenol pthalein).
SO 4 +2 H 2 O ¿
( NH 4 )2 SO 4 +2 NaOH → 2 NH +¿+Na
3
2

3. Proses Titrasi Titrasi merupakan tahap akhir dari seluruh metode Kjeldahl

pada penentuan kadar protein dalam bahan pangan yang dianalisis. Apabila

penampung destilat digunakan HCl maka sisa HCl yang bereaksi dengan

NH +¿¿
4 dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Titik akhir titrasi ditandai

dengan tempat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak

hilang selama 30 detik bila menggunakan indicator PP.

14 x ( t titran(ml)−t blanko (ml) ) x(N titran)

%N = x 100 %
berat sampel ( g ) x 1000

Apabila penampungan destilasi digunakan H3BO3 maka banyaknya H3BO3

+¿¿
yang bereaksi dengan NH 4 dapat diketahui dengan titrasi menggunakan

HCl 0,1 N dengan indicator (BCG-MR). Titik akhir titrasi ditandai dengan

perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda.

HBO +H B O3 ( hijau muda ) ¿
NH 3+ H 3 BO3 → NH +¿:
4
3 3

: HBO + HCl → NH Cl+2 H BO3(hijau ungu→ungu muda)¿

2 NH +¿
4
3 4 3

Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan

mengalikan suatu factor. Besarnya factor perkalian N menjadi protein ini

tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.

 Protein mengandung 16% nitrogen, sehingga perhitungan kadar protein total:

100
%protein= x %N=6,25 x %N
16

Alat & bahan

Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah Kjeldahl Flask, alat destilasi,

Erlenmeyer flask, beaker glass, graduated cylinder (gelas ukur), thermometer,

medicine dropper (pipet tetes) dan heater (alat pemanas).

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah sampel makanan yang

diduga mengandung protein, K2SO4(Potassium sulfate), HgO (Mercury(II)

oxide), H2SO4 (Sulfuric acid), Lempeng Zn (Zinc), NaOH 0,1N (Sodium

hydroxide), HCl 0,1N (hydrochloric acid), indicator phenolphthalein, Aquadest

dan Air es

Prosedur kerja

Ditimbang 250 mg Kacang hijau, bahan yang telah dihaluskan dan dimasukkan

dalam labu Kjeldahl (kalau kandungan protein tinggi, misal kedelai gunakan

bahan kurang dari 1 g) kemudian ditambahkan 7,5 g Kalium Sulfat (K 2SO4) dan

0,35 g Raksa Oksida (HgO) dan 15 ml H2SO4. Dipanaskan semua bahan dalam

labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan diteruskan

pemanasan sampai mendidih dan cairan sudah menjadi jernih. Ditambahkan

pemanasan kurang lebih 30 menit, matikan pemanasan dan biarkan sampai

dingin. Selanjutnya ditambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang

didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, ditambahkan 15 ml larutan

Kalium Sulfat (K2SO4) 4% (dalam air) dan akhirnya ditambahkan perlahan-lahan

Larutan Natrium Hidroksida (NaOH) 50% sebanyak 50 ml yang telah

didinginkan dalam lemari es. Dipasang labu Kjeldahl dengan segera pada alat

destilasi. Dipanaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan

tercampur, kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih. Destilasi

ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku Asam Klorida

(HCl) 0,1 N sebanyak 50 ml dan indicator phenolphthalein 0,1% b/v (dalam

etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke

dalam larutan asam klorida 0,1N. Proses destilasi selesai jika destilat yang

ditampung lebih kurang 75 ml. Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak

bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N.

Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah

menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko.