Nama : Mira Junita

NPM : 10060315008
Kelas : Farmasi A

Pengembangan dan metode validasi HPLC

Kimia analisis dibagi dua ada analisis kualitatif dan kuantitatif. Namun untuk analisis
sampel obat, formula sediaan farmasi, cairan biologis menggunakan instrumen berbeda. Instrumen
kimia harus berdasarkan pada pengukuran substansi yang didasarkan pada komposisi kima. Dalam
menggunakan instrumental akan diperoleh hasil dengan proses yang sederhana, presisi dan
reprodusibel. Biasanya digunakan instrumen yang mutakhir seperti spektrofotometri, HPLC,
kromatografi gas, HPTLC. Instrumen ini mempunyai aplikasi yang luas untuk menjamin kualitatif
dan kuantitatif dari bahan baku dan produk jadi.
 Kromatografi
Metode untuk memisahkan suatu senyawa dari campurannya yang terdistribusi dari 2 fase yang
tidak bercampur. Dimana zat terlarut dipisah oleh perbedaan migrasi.
 Prinsip Kromatografi
- Kromatografi Adsorpsi
Fase diam: Padat
Fase gerak : Cair atau gas
Contoh: KLT, KOLOM, kromatografi gas padat
- Kromatografi Partisi
Fase diam: cair
Fase gerak : Cair
Contoh: kromatografi kertas, kromatografi gas cair.
 Fase Kromatografi
1. Fase normal ( fase diam polar dan fase gerak non polar)
Senyawa non polar akan terelusi lebih dulu karena ikatanya lemah antara senyawa polar
dengan fase diam, sehingga senyawa polar tertahan lebih lama
2. Fase balik ( fase diam non polar dan fase gerak polar)
Banyak digunakan dalam bidang farmasi. Kolom yang digunakan : ODS, C18, C8 dan C4
 3. Pertukaran ion
Fase diam mengandung gugus ionik : NR 3+, SO3- yang akan berinteraksi dengan molekul
sampel. Hanya untuk molekul yang bermuatan saja
4. Pasangan Ion
Disebut kromatografi terbalik dengan pasangan ion, dan memungkinkan dilakukan
pemeriksaan senyawa ionik, asam kuat.
5. Afinitas
Fase diam mengandung kelompok molekul yang spesifik yang dapat menyerap sampel
sterik. Kromatogrrafi afinitas banyak dilakukan pada iisolasi protein, enzim dan antibodi.
6. Eklusi Ukuran
Memisahkan molekul sesuai dengan masa, dimana molekul besar akan terelusi lebih dulu.
Metode ini digunakan untuk senyawa yang memiliki perbedaan massa molekul minimal
10%
Eklusi ukuran kromatografi permeasi gel
Filtrasi gel
 Pengembangan metode
Untuk memastikan identitas, kemurnian, potensi serta kinerja produk obat. Untuk melakukan
pengembangan metode diantaranya: pengumpulan informasi (Pka, Log P, Kelarutan).
Hal yang terlibat dalam pengembangan metode:
- Sifat fisiko kimia obat
Untuk pengembangan metode kita harus mempelajari sifat fisik seperti kelarutan, polaritas, pKa
dan pH dari molekul obat. Polaritas memutuskan pelarut dan komposisi fase gerak, bahan yang
memiliki sifat kepolaran yang sama akan bercampur satu sama lain. Analit harus dapat terlarut
dalam pengencer dani tidak bereaksi dengan salah satu komponen pengencer tersebut .
pengencer harus sesuai dengan komposisi eluen mulai dari tes untuk memastikan bahwa tidak
ada puncak distorsi yang akan terjadi, terutama untuk komponen yang terelusi petama. pH dan
pKa Nilai pH didefinisikan sebagai negatif logaritma basis 10 dari konsentrasi ion hidrogen,
pH = - log 10. Pemilihan pH yang tepat untuk analit yang dapat terionisasi akan menghasilkan
puncak yang simetris dan tajam dalam HPLC. Keasaman suatu larutan ditentukan oleh
konsentrasi ion [H3O+]. Dengan demikian, pH larutan menunjukkan konsentrasi ion hidrogen
dalam larutan. Konsentrasi ion hidrogen dapat diindikasikan sebagai [H+] atau bentuk terlarut
 dalam sebagai [H3O+]. yang nilainya biasanya terletak di antara 0 dan 14. Semakin rendah pH,
semakin asam adalah larutan. PH larutan dapat diubah hanya dengan menambahkan asam atau
basa ke larutan pKa menunjukan karakteristik dari komoponen partikulat yang menunjukan
kemampuan partikel melepas kan proton.
- Kondisi HPLC
Buffer adalah asam yang dinetralkan sebagian yang menolak perubahan pH. Garam seperti
Natrium Sitrat atau Natrium Laktat biasanya digunakan untuk menetralkan sebagian asam.
Kapasitas buffering meningkat jika konsentrasi molar (molaritas) dari buffer garam / asam
solusi meningkat, Semakin dekat pH buffer terhadap pKa, semakin besar kapasitas buffering,
Kapasitas buffering dinyatakan sebagai molaritas Sodium Hidroksida diperlukan untuk
meningkatkan pH 1,0. Pemilihan buffer yang tepat, dalam hal spesies buffering, kekuatan ion
dan pH, dapat mengakibatkan terjadinya retensi yang rendah atau irreproducible dan tailing di
pemisahan fase-balik senyawa polar dan terionisasi.
Pemilihan buffer
Pilihan penyangga biasanya diatur oleh pH yang diinginkan. Rentang pH khas untuk fase
terbalik pada kemasan berbasis silika adalah pH 2 sampai 8. Buffer sangat penting memiliki
pKa dekat dengan pH yang diinginkan .
Pertimbangan umum untuk pemilihan penyangga:
Fosfat lebih larut dalam metanol / air daripada di asetonitril / air atau THF / air ; Beberapa
buffer garam higroskopis. Hal ini dapat menyebabkan perubahan dalam kromatografi
(peningkatan tailing dari senyawa basa, dan mungkin perbedaan selektivitas); garam amonium
umumnya lebih larut dalam fase gerak organik / air ; TFA dapat diturunkan sengan waktu,
volatile, terserap pada panjang gelombang rendah; pertumbuhan mikroba dapat dengan cepat
terjadi pada ponsel Buffered fase yang mengandung sedikit atau tidak ada pengubah organik.
Pertumbuhan ini akan menumpuk pada kolom dan dapat merusak kinerja kromatografi; Pada
pH lebih besar dari ; penyangga fosfat mempercepat kerusakan silika dan sangat memperpendek
masa hidup kolom HPLC berbasis silica; fase gerak harus degassed.
Konsentrasi buffer
Umumnya, buffer konsentrasi 10-50 mM cukup untuk molekul kecil. Umumnya, tidak lebih
dari 50% organik harus digunakan dengan penyangga. Ini akan tergantung pada buffer tertentu
serta konsentrasi. asam fosfat dan natrium atau kalium garamnya adalah sistem penyangga
paling umum untuk fase terbalik HPLC.
Pemilihan detektor
Detektor UV-Visible merupakan detektor serbaguna, dual detektor panjang gelombang
absorbansi untuk HPLC. detektor ini menawarkan sensitivitas tinggi yang diperlukan untuk
aplikasim berbasis UV rutin untuk mengidentifikasi ketidak murnian dan analisis kuantitatif.
Photodiode Array (PDA) Detector menawarkan deteksi optik canggih untuk Waters HPLC
analitis, HPLC preparatif, atau larutan sistem LC / MS. PDA terintegrasi software dan optik
inovasi memberikan Hasil kromatografi tinggi dan sensitivitas spektral. Indeks bias (RI)
Detector menawarkan sensitivitas tinggi, stabilitas dan reproduktifitas, yang membuat detektor
ini menjadi solusi ideal untuk analisis komponen dengan penyerapan UV terbatas atau tidak
ada.
Pemilihan kolom
Inti dari sistem HPLC adalah kolom. Mengubah kolom akan memiliki pengaruh terbesar pada
resolusi analit selama pengembangan metode. Umumnya, fase balik kolom HPLC yang dibuat
oleh kemasan kolom dengan silika gel yang dilapisi dengan fase diam hidrofobik. Secara
umum, sifat fase diam memiliki efek terbesar pada factor kapasitas, selektivitas, efisiensi dan
elusi. Ada beberapa jenis matriks untuk mendukung fase diam, termasuk silika, polimer, dan
alumina. Silica adalah matriks yang paling umum untuk kolom HPLC. Matriks silika kuat,
mudah diderivatisasi, dan tidak cenderung untuk kompres di bawah tekanan. Silica secara
kimiawi stabil untuk sebagian besar pelarut organik dan sistem pH rendah. Satu kekurangan
dari padat adalah silica dapat larut pada pH diatas 7. Fase diam untuk kromatografi fase baik
diantaranya: kolom C 4 ( butil), C 8 ( oktil), C18 (oktadesil), nitril (sianopropil), dan fenil (fenil
propil). Kolom untuk kromatografi pasangan ion-. Contoh: Zorbax SB-C 3, YMC-Pack C 4,
dan Luna C 5. kolom fenil biasanya digunakan untuk menyelesaikan senyawa aromatik.
Contohnya termasuk Zorbax SB-Phenyl, YMC-Pack Phenyl dan Luna Phenyl-Hexyl. Nitril
(CN atau siano) kolom polar dan dapat digunakan untuk kedua terbalik dan aplikasi fase normal.
Temperatur kolom
suhu kolom penting untuk metode jangka panjang reproduktifitas, dan mempengaruhi
selektivitas. Sebuah target suhu di kisaran 30-40 ° C biasanya cukup untuk reproduktifitas baik.
Penggunaan suhu tinggi dapat menguntungkan karena beberapa alasan. Pertama, beroperasi
pada suhu lebih tinggi dapat mengurangi viskositas fase gerak secara keseluruhan terhadap
tekanan balik pada kolom. tekanan sistem yang lebih rendah memungkinkan untuk tingkat
aliran lebih cepat dan analisis sehingga lebih cepat.
Jenis Fase gerak
Dalam kromatografi fase terbalik, fase gerak terdiri dari larutan buffer dan air non uv aktif yang
larut pelarut organic . Efek dari fase organic dan air dan proporsi di mana mereka dicampur
akan mempengaruhi analisis molekul obat. Pemilihan kondisi fase gerak dan gradient
tergantung pada sifat ionogenic analit dan hidrofobisitas analit dalam campuran masing-
masing. larutan buffer mempunyai beberapa tujuan. Pada pH rendah, fase geraknterprotonasi
silanols bebas di kolom dan mengurangi puncak tailing. Pada pH yang cukup rendah analit
dasar terprotonasi ketika terionisasi analit akan mengelusi lebih cepat tapi dengan perbaikan
bentuk puncak. analit asam dalam buffer pH yang cukup rendah tetap tidak berubah,
meningkatkan retensi. Sebaliknya, pada pH yang lebih tinggi senyawa netral akan lebih
dipertahankan, dan senyawa asam terionisasi akan terelusi lebih awal.
Teknik pemisahan
Teknik pemisahan pemisahan isokratik: isokratik

Komposisi eluen konstan berarti kondisi keseimbangan dalam kolom dan kecepatan yang
sebenarnya dari senyawa bergerak melalui kolom yang konstan; analit-eluen dan analit-
stasioner-fase Interaksi juga konstan di seluruh run. Hal ini membuat pemisahan isokratik lebih
mudah diprediksi, meskipun kekuatan pemisahan (jumlah senyawa yang dapat diselesaikan)
tidak terlalu tinggi. Kapasitas puncak rendah dan komponen senyawa tertahan lama pada
kolom, puncak yang dihasilkan lebih luas.

Teknik pemisahan gradien

Pemisahan gradien secara signifikan meningkatkan kekuatan pemisahan sistem terutama karena
peningkatan dramatis dari efisiensi jelas (penurunan puncak lebar). Kondisi di mana ekor zona
kromatografi selalu di bawah pengaruh komposisi eluen kuat mengarah pada penurunan lebar
puncak. Lebar puncak bervariasi tergantung pada tingkat variasi komposisi eluen (kemiringan
lereng). Ketika metode gradien digunakan, kolom harus diizinkan untuk menyeimbangkan pada
kondisi fase gerak-tahap awal sebelum injeksi sampel berikutnya dan awal gradien berikutnya
run. Ini akan dikaitkan dengan lereng yang berbeda dari retensi terhadap komposisi organik
 untuk setiap analit dalam campuran. Ketika metode gradient digunakan, kolom harus diizinkan
untuk menyeimbangkan pada kondisi ponsel-tahap awal sebelum injeksi sampel berikutnya dan
awal gradien berikutnya run. Ini akan dikaitkan dengan lereng yang berbeda dari retensi
terhadap komposisi organik untuk setiap analit dalam campuran. Ketika metode gradien
digunakan, kolom harus diizinkan untuk menyeimbangkan pada kondisi fase gerak-tahap awal
sebelum injeksi sampel berikutnya dan awal gradien berikutnya run.

Pemilihan teknik isokratik atau gradien tergantung pada jumlah komponen aktif yang akan
dipisahkan. Dalam memutuskan apakah gradien atau isokratik akan cukup, gradient awal run
dilakukan, dan rasio antara total waktu gradien dan perbedaan waktu gradien antara komponen
pertama dan terakhir yang terhitung. Rasio dihitung adalah <0,25, isokratik memadai; ketika
rasio> 0,25, gradien akan bermanfaat

- Preparasi sampel
Selama pengembangan metode awal, persiapan dari larutan harus dilakukan sampai ditentukan
bahwa komponen aktif stabil pada suhu kamar dan tidak menurun dalam kondisi laboratorium
normal. Larutan sampel harus disaring; umumnya direkomendasikan penggunaan 0,22 atau
0,45 m pori-ukuran filter untuk menghilangkan partikulat. Filtrasi adalah pencegahan sekaligus
alat pemeliharaan untuk analisis HPLC. Persiapan sampel merupakan langkah penting dari
pengembangan metode . Efektivitas filter jarum suntik sangat ditentukan oleh kemampuan
mereka untuk menghilangkan kontaminan / tidak larut komponen tanpa pencucian artefak yang
tidak diinginkan (yaitu, diekstrak) ke filtrat. Jika ada puncak tambahan yang diamati pada
sampel disaring, maka pengencer harus disaring untuk menentukan apakah komponen yg dapat
meluluhkan datang dari jarum suntik filter
- Metode optimasi
Kondisi eksperimental harus dioptimalkan untuk mendapatkan pemisahan dan sensitivitas yang
diinginkan setelah mendapatkan pemisahan yang tepat. Stabilitas menunjukkan kondisi uji
eksperimental akan dicapai melalui direncanakan / pemeriksaan sistemik pada parameter
termasuk pH (jika ion), komponen fase gerak dan rasio, gradien, tingkat, suhu, jumlah sampel,
volume yang Injection dan jenis pelarut.
- metode validasi
Validasi prosedur analitis adalah proses yang didirikan, oleh penelitian laboratorium, yang
menunjukan bahwa karakteristik kinerja prosedur memenuhi persyaratan untuk digunakan.
Proses metode validasi untuk prosedur analitis dimulai dengan pengumpulan terencana dan
sistematis oleh pemohon dari data validasi untuk mendukung prosedur analitis. Semua metode
analisis yang dimaksudkan untuk digunakan untuk menganalisa sampel klinis apapun akan
perlu divalidasi. Validasi metode analisis dilakukan sesuai pedoman ICH

Parameter validasi
berikut ini adalah khas analitis prestasi karakteristik yang dapat diuji selama metode validasi:
· Ketepatan
Kedekatan nilai diukur dengan nilai benar atau diterima. Akurasi menunjukkan deviasi antara
nilai rata-rata ditemukan dan nilai sebenarnya. Ini harus dianalisis terhadap larutan standar dan
kosong untuk memastikan bahwa tidak ada gangguan. presisi Menengah adalah variasi dalam
laboratorium seperti hari yang berbeda, dengan instrumen yang berbeda, dan oleh analis yang
berbeda. presisi ini kemudian dinyatakan sebagai r elative standar deviasi.
· Ketelitian
tingkat kesepakatan antara hasil tes individu diperoleh ketika metode ini diterapkan ke beberapa
sampel dari sampel homogen. Presisi adalah ukuran reproduksibilitas metode analisis secara
keseluruhan
· Pengulangan
Variasi yang dialami oleh seorang analis tunggal pada satu instrumen. Selama validasi,
pengulangan dilakukan dengan menganalisis beberapa ulangan dari sampel komposit uji
dengan menggunakan metode analisis
· Presisi menengah
Variasi dalam laboratorium seperti hari yang berbeda, dengan instrumen yang berbeda, dan
oleh analis yang berbeda. presisi ini kemudian dinyatakan sebagai r elative standar deviasi.
· Linearitas
kemampuan prosedur analitis untuk mendapatkan respon yang berbanding lurus dengan
konsentrasi (jumlah) dari analit dalam sampel. Jika metode ini linear, hasil tes secara langsung
atau dengan transformasi matematis didefinisikan dengan baik sebanding dengan konsentrasi
analit dalam sampel dalam kisaran tertentu. Linearitas biasanya dinyatakan sebagai batas
kepercayaan sekitar kemiringan garis regresi
· Batas deteksi
jumlah terendah analit dalam sampel yang dapat dideteksi tetapi tidak harus kuantitatif menilai
sebagai nilai yang pasti
· Batas kuantisasi
jumlah terendah analit dalam sampel yang dapat secara kuantitatif ditentukan dengan presisi
dan akurasi yang cocok. Untuk prosedur al analitik seperti HPLC yang menunjukkan suara
awal, LOQ
umumnya diperkirakan dari penentuan S / N rasio (10: 1) dan biasanya dikonfirmasi dengan
menyuntikkan standar yang memberikan ini S / N ratio dan memiliki persen relatif dapat
diterima standar deviasi juga.
· Spesifisitas
kemampuan untuk menilai tegas analit di hadapan komponen yang dapat diharapkan untuk
hadir seperti kotoran, produk degradasi, dan eksipien. langkah-langkah kekhususan hanya
komponen yang diinginkan tanpa gangguan dari spesies lain yang mungkin hadir; pemisahan
tidak selalu diperlukan.
Efisiensi kolom
Ukuran band penyebaran puncaknya. Lebih kecil band menyebar, lebih tinggi adalah jumlah
pelat teoritis, menunjukkan baik kolom dan kinerja sistem. Kolom dengan N mulai dari 5.000
hingga 100.000 Pelat / meter yang ideal untuk sistem yang baik. Efisiensi dihitung dengan
menggunakan rumus

Faktor puncak asimetri (As) dan faktor tailing

Puncak faktor asimetri (As) dapat digunakan sebagai kriteria kinerja kolom. Puncak asimetri
diukur pada 10% dari tinggi puncak penuh, dibagi dengan sesuai setengah lebar depan.
(Gambar-3) Faktor asimetri dihitung oleh. Faktor asimetri = B / A . dimana B = setengah lebar
Puncak, A = depan setengah lebar kolom Baik menghasilkan puncak dengan Sebagai nilai 0,95
1%
· Kekokohan
ukuran kemampuan suatu metode analisis untuk tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil tapi
disengaja dalam parameter metode (misalnya pH, komposisi fase gerak, suhu dan pengaturan
instrumental) dan memberikan indikasi kehandalan selama penggunaan
· Kesesuaian sistem penentuan
evaluasi komponen system analisis menunjukkan bahwa kinerja sistem memenuhi standar yang
dibutuhkan oleh metode. Parameter ini dapat dihitung secara eksperimen untuk memberikan
laporan pengujian kesesuaian sistem kuantitatif: jumlah pelat teoritis (efisiensi), faktor
kapasitas, pemisahan (retensi relatif), resolusi, tailing faktor, relatif standar deviasi (presisi). Ini
diukur pada puncak atau puncak waktu retensi dikenal dan lebar puncak
· Studi degradasi paksa
digunakan untuk mengevaluasi kemampuan suatu metode analisis untuk mengukur bahan aktif
dan produk degradasi, tanpa gangguan, dengan menghasilkan potensi produk degradasi. Selama
validasi metode, zat obat yang terkena asam, basa, panas, cahaya dan agen oksidasi untuk
menghasilkan sekitar 10% sampai 30% degradasi zat aktif Studi ini juga dapat membantu dalam
pengembangan formulasi, manufaktur, dan kemasan untuk meningkatkan produk obat
Kesimpulan
Ulasan ini menjelaskan teknik umum HPLC pengembangan metode dan validasi metode
dioptimalkan. Pendekatan umum untuk pengembangan metode untuk pemisahan senyawa
farmasi dibahas. Pengetahuan tentang pKa, pH dan kelarutan senyawa utama adalah sangat
penting sebelum pengembangan metode HPLC. Pengetahuan tentang pH dapat membantu
untuk membedakan sifat terionisasi dari kotoran lainnya (yaitu, produk sampingan sintetis,
metabolit, produk degradasi, dll) dalam campuran. Pemilihan penyangga dan komposisi fase
gerak (organik dan pH) memainkan peran dramatis pada selektivitas pemisahan. Optimasi akhir
dapat dilakukan dengan mengubah suhu, kemiringan lereng, dan laju aliran serta jenis dan
konsentrasi pengubah ponsel-fase. Metode dioptimalkan divalidasi dengan berbagai parameter