HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

00.49  LANSIDA  74 comments

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an
dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam
sediaan farmasetik. 

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat
untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung
buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih
polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di
pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama
elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi
bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)
 
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon,
dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan
sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3
mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan
dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang
terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk
sampel (sample loop) internal atau eksternal.
 Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:

 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol
(Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen
seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,
sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai
untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok
sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan
memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan
air yang digunakan. 

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa;
dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik
detektor seperti berikut :
Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik
(g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling sering
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 digunakan, selektif terhadap
spektrometer photo- > 2 x 10-10 105 gugus-gugus dan struktur-struktur
diode array yang tidak jenuh.
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus, selektif,
Tidak peka terhadap perubahan
suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan
tetapi sensitivitasnya sedang.
Sangat sensitif terhadap suhu, dan
tidak dapat digunakan pada elusi
bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan suhu
Amperometri 10-12 105 dan kecepatan alir fase gerak, tidak
dapat digunakan pada elusi
bergradien. Hanya mendeteksi
solut-solut ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi timbul
masalah dengan adanya
kontaminasi elektroda.
JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya
kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua
pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal
dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat
fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis
HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi
kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya
menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina,
meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase
diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda,
karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika
adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana,
oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah
oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau
dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah,
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan
mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika
solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran,
meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya
air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak
air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta
oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi
solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan
ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 2)

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul >
2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat
fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi
terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir
adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang
besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan
demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia
antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang
sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat
menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik
tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan
antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.2)

DERIVATISASI PADA HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen
untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan
derivatisasi pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan
puncak kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
4. Menstabilkan analit yang sensitif.5)

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis

sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan
gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di
samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor
(senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan
fluorometri.7)
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni:
produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar
tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi
dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan
produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama
proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus
tidakmenganggu pemisahan kromatografi.7)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Gugus fungsional Reagen untuk dapat dideteksi Reagen untuk dapat
dengan UV-Vis dideteksi dengan Fluoresen
Asam-asam p-nitrobenzil-N,N’- 4-bromometil-7-
kaboksilat; asam- diisopropilisourea (PNBDI); 3,5- asetoksikumarin;
asam lemak;asam- dinitrobenzil-N,N’- 4-bromometil-7-
asam fosfat diisopropilisourea (DNBDI); p- metoksikumarin;
bromofenasil bromida (PBPB)
Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4-
dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil
(Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).
Aldehid; keton p-nitrobenziloksiamin hidroklorida Dansil hidrazin
(PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin primer Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
Amin primer (1o) dan 3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); N- 7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-
sekunder (2o) suksinimidil-p-nitrofenilasetat 1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-
(SNPA); N-suksinimidil-3,5- 4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-
dinitrofenilasetat (SDNPA); 4- diazol (NBD-F); Dansil klorida
dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil
(Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).
Asam-asam amino 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil Fluoresamin
(peptida) (Dabsil-Cl) o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-
1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-
4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-
diazol (NBD-F);
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column
derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).

Referensi:

1. Settle, F (Editor), 1997, Handbook of Instrumental Techniques for

Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.
2. Meyer, F.R., 2004, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th
Ed., John Wiley & Sons, New York.
3. Kealey, D and Haines, P.J., 2002, Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS
Scientific Publishers Limited, New York.
4. Kenkel, J., 2002, Analytical Chemistry for Technicians, 3th. Edition., CRC
Press, U.S.A.
5. Snyder, L. R.,  Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method
Development, John Wiley & Son, New York.
6. Munson, J.W., 1981, Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods, Part A and
B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga University Press,
Surabaya.
7. Cserhati, T. And Forgacs, E., 1999, Chromatography in Food science and
Technology, Technomic Publishing, Lancaster, Basel.

Posted in: Alat Instrumen

Komponen-komponen pada HPLC

 
Pada gambar diatas dapat terlihat bahwa komponen-komponen dari HPLC yaitu
a.tempat sampel
b. injektor
c. detektor
d. pompa
e. mesin pengendali
 untuk lebih lengkapnya bagian-bagian dari HPLC yaitu
1.    Tempat sampel

    Tempat sampel berfungsi untuk mengimpan sampel yang akan dipisahkan dalam HPLC dimana
sampel yang digunakan disimpan dalam botol kemudian dimasukkan kedalam tempat tersebut.
Tempat ini menyimpan banyak botol sampel hal inilah yang menjadi kelebihan dari proses
pemisahan dengan menggunakan HPLC karena dapat memisahkan sampel dengan jumlah yang
banyak.

2.    Injektor

 Injektor adalah alat yang digunakan untuk menginjeksi sampel yang akan dipisahkan.Ada tiga tipe
dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak
dipengaruhi
b.    Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi
Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan
dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat
jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c.    Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10
μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang
lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada
kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.

3.    Detektor

                  Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki
sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi
respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi
temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
              Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang
gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas.
Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi
umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: (1)
mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel; (2) mempunyai sensitifitas yang
tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil; (3) stabil dalam
pengopersiannya; (4) mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita; (5) signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier); dan (6) tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak2)
4.    Pompa

         Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai
untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
5.    Kolom

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional,
yakni: Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom
konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
•    Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung
dengan spektrometer massa.
•    Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini
sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan
kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang
dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil
benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan.
Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu
memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau
rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan
sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan
air yang digunakan.
6.    Botol pelarut

        Botol pelarut merupakan wadah tempat menyimpan eluent yang akan digunakan untuk
mengaliri fasa diam. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1). Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase
diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk
fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnyapolaritaspelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan
detektor sehingga akan mengacaukan analisis.  Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik
(komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi
bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel
mempunyai kisaran polaritasyangluas4).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase
normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon
dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik
7.    Selang penghubung

Selang penghubung yaitu berfungsi untuk menghubungkan eluent dengan kolom

8.    Mesin pengendali

Mesin pengendali merupakan bagian yang terpenting dalam proses pemisahan ini karena mesin
pengendali berfungsi sebagai sebagai alat untuk mengendalikan semua proses pemisahan yang
sedeng berlangsung.
9.    Komputer
    Kumputer merupakan alat yang digunakan untuk membaca pembacaan kromatogram yang telah
dihasilkan pada perconbaan ini.

B.    PRINSIP DASAR DAN CARA KERJA DARI HPLC

1.    Prinsip dasar dari HPLC
Prinsip dasar dari HPLC yaitu didasarkan pada partisi cair-cair Teknik ini terdiri dari suatu kolom yang
berisi zat padat penunjang halus di mana pada permukan terdapat pelarut sebagai fase diamnya.
Fase kedua, yaitu fase bergerak yang tidak bercampur dengan cairan dari fase diamnya akan
mengalir sepanjang kolom. Komponen-komponen yang terpartisi lebih banyak pada fase diam akan
bertahan lebih lama di dalam kolom dibandingkan yang lebih banyak terpartisi pada fase gerak.
2.    Cara kerja dari HPLC
Prinsip kerja HPLC ialah dengan bantuan pompa fase gerak cair dialirkan melalui kolom menuju
detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikkan. Di dalam
kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi
antara  solute-solut terhadap fase diam  Solut-solut yang kuat interaksinya dengan fase diam akan
keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebalikya, solute-solut yang kuat berinteraksinya dengan fase
diam maka solute tersebut akan keluar kolom, dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system
HPLC dan mengumpulkan serta mengolah hasil data pengukuran HPLC.
1.      HPLC dihubungkan dengan sumber arus, lalu computer, monitor, dan printer dinyalakan.
2.      Pompa HPLC dan detector UV dengan cara menekan tombol ON/OFF pada masing-masing alat.
3.      Lalu Analiyst Komputer dipilih.
4.      Setelah itu membuka LC Solution.                                                                                                   5.     
Kondisi eluen dicek terlebih dahulu, jika terdapat gelembung udara harus disaring dengan   
menggunakan saringan 0,45 mikron. Kemudian dick kembali cairan eluen yang menuju pompa.
Apabila juga masih terdapat gelembung udara maka harus dilakukan PURGE menggunakan drain
dengan tujuan mengeluarkan udara dari eluen sehingga tidak mengganggu proses pemisahan.            
6.      Purge dilakukan dengan cara memutar tombol drain berlawanan jarum jam, bersamaan dengan
ditekannya tombol purge pada pompa. Sehingga eluen yang membawa gelembung akan keluar
melalui pembuangan.
7.      Pilih menu File lalu pilih new Method File.                                                                                     8.     
Apabila belum memasukkan metode, harus menyettingnya dahulu di instrument parameter view.
9.      Ketik kecepatan fase gerak Pump A Flow.
10.  Ketik panjang gelombang analisa yang diinginkan pada colom wave length  chl.
11.  Ketik waktu analisa yang diperlukan pada kolom stop time
12.  Klik file, save method file as… masukkan nama metode, klik save
13.  Kirim perintah ke alat, klik Download
14.  Klik instumen On/off.yang telah dibuat, klik download, lalu instrument on/off  untuk menyalakan
dan mematikan alat, tidak usah setting perhitungan.
15.  Untuk membuka metoda yag telah dibuat, klik 2x methode
 16.  Setelah kondisi stabil artinya didiamkan atau warming up selama 15 menit, sampel diambil
menggunakan syringe dan jaga samapai terdapat gelembung udara diadalamnya. Apabila terdapat
gelembung udara, maka dilakukan teknik dengan cara mengeluar masukkan sample dalam syringe
hingga gelembung tersebut  hilang.
17.  Untuk menginjekkan sample, klik single start
18.  Masukkan nama sample, id sample dan juga data file.
19.  Tunggu sampai ada tampilan data achquisition start.
20.  Kemudian sample di injeksikan ke dalam colom.
21.  Masukkan jarum syringe pada lubang sample, lalu ditekan perlahan hingga tak bisa ditekan lagi.
Posisi syringe harus tegak lurus, lalu putar ke posisi load (naikkan ke atas), injeksikan sample,  lalu
injector diputar kembali ke posisi inject (turun ke bawah)
 22.  Hasil pemisahan akan dibawa ke dalam colom dan dibawa ke detector, sehingga ditampilkan
pada layar monitor.
C. Diagram alir

     
D.    Kelebihan dan kekurangan
1.    Kelebihan dari HPLC
• mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
• mudah melaksanakannya
• kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
• dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
• Resolusi yang baik
• dapat digunakan bermacam-macam detektor
• Kolom dapat digunakan kembali
• mudah melakukan "sample recovery"
2.    Kekurangan dari HPLC
a.    Memerlukan biaya yang banyak untuk proses pemisahannya
b.    Memerlukan orang yang trampil dalam proses pemisahannya.

                                                                   BAB III

                                                                PENUTUP

A.    Kesimpulan
    Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan ini yaitu HPLC secara mendasar
merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes
melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini
membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi
antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang
lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Perkembangan yang lebih luas melalui
kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-
metode ini sangat otomatis dan sangat peka.
B.    Saran
       Adapun saran yang dapat diberikan dalam percobaan ini yaitu sebaiknya dalam pengoperasian
ini lebih berhati-hati karena bahan yang dipergunakan sedikit dan harga barangnya relatif mahal.
DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2011. Laporan praktikum HPLC. http://www.scribd.com/doc/24898561/Laporan-Praktikum-

HPLC-rtf (diunduh 2012/05/30)
Anonim. 2010. Laporan HPLC krisna. http://www.scribd.com/doc/92550514/LAPORAN-HPLC-KRISNA
http://www.scribd.com/doc/61788584/laporan-pelatihan-HPLC ( diunduh 2012/05/30).
Anonim. 2011. Laporan HPLC. http://instrumentituasyiklhoo.blogspot.com/2012/05/laporan-
hplc.html  ( diunduh 2012/05.29)
Prinsip Dasar HPLC

Sesuai namanya, prinsip HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur sampel.
Dalam kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul berdasarkan
perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut terjadi saat sampel bergerak
melewati fase diam (dapat berupa zat padat atau cair) karena terbawa oleh fase gerak (dapat
berupa zat cair atau gas).

Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap
fase diam. Komponen yang dapat berinteraksi secara kuat dengan fase diam akan bergerak
lebih lambat sehingga dapat terpisah dari komponen lain dengan interaksi yang lemah.
 

Kromatografi kertas

Pada kromatografi kertas, sampel yang diteteskan di bagian ujung kertas kromatografi (fase
diam) akan lambat laun bergerak dan terpecah komponennya seiring dengan pergerakan
cairan pada dasar kertas (fase gerak). HPLC pun demikian, sampel yang diinjeksikan
bergerak melalui fase diam dalam kolom karena terbawa oleh fase gerak.

Apa yang membedakan HPLC dengan metode Kromatografi lainnya?

Sebagai salah satu metode kromatografi cair (liquid chromatography), HPLC menggunakan
zat cair sebagai fase geraknya. Sampel yang telah dilarutkan dapat dipisahkan dan dihitung
konsentrasi zat spesifik yang terkandung di dalamnya. Sebagai contoh, kandungan kafein
dalam sampel minuman dapat diukur dengan HPLC berdasarkan afinitas kafein terhadap fase
diam pada kolom yang digunakan.
 

Diagram di atas menunjukkan komponen utama yang terdapat pada HPLC. Larutan sampel
diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh fase gerak (1) melewati fase diam pada
kolom (5), kemudian hasilnya dibaca oleh detektor (6) dan ditampilkan pada pengolah data
(7) sebagai kromatogram.

Berbeda dengan kromatografi kolom tradisional yang memanfaatkan gravitasi agar fase gerak
dapat melalui fase diam, HPLC menggunakan pompa bertekanan tinggi (2) untuk
mengalirkan fase gerak menuju kolom fase diam.
 

Kromatografi kolom

Fase diam yang digunakan dalam HPLC dapat terdiri dari partikel dengan pori berukuran
mikron sehingga tekanan tinggi diperlukan agar fase gerak dan sampel dapat bergerak
melewati pori tersebut. Penggunaan tekanan tinggi inilah menyebabkan metode ini
dinamakan High Performance Liquid Chromatography atau yang dulu disebut juga sebagai
High Pressure Liquid Chromatography.

Instrumentasi HPLC

Kalau kamu melihat lagi diagram HPLC di atas, HPLC terdiri atas beberapa komponen utama
yang digunakan dalam analisis sampel. Berikut akan dibahas mengenai masing-masing
komponen yang perlu kamu tahu.

1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut

Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi.
Idealnya, pelarut khusus yang memang sudah memenuhi standard untuk HPLC dipergunakan
untuk hasil yang lebih akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fase gerak,
biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung.
 

Kiri: Methanol khusus HPLC ; Kanan: Reservoir yang terhubung ke pompa

2. Pompa

Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, pompa yang digunakan dalam HPLC haruslah
pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom
fase diam dan melewati detektor. Tekanan yang digunakan beragam tergantung dari dimensi
kolom, ukuran partikel fase diam, serta laju alir dan komposisi dari fase gerak yang akan
dipakai.
 

Pompa HPLC

3. Injektor

Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi dapat
dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem injeksi otomatis.
Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam kisaran volume 0.1-100
mL.

Sistem injeksi otomatis

4. Sampel

Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat bening dan tidak ada
endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan sebelum dianalisis, misalnya dengan
melakukan filtrasi sampel. Preparasi lain dapat pula dilakukan sesuai kebutuhan seperti
mengatur konsentrasi sampel, desalting, dan lain-lain.

5. Kolom HPLC

Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai fase diam. Di dalam kolom
akan terjadi pemisahan komponen sampel yang kemudian dapat dihitung waktu retensi
masing-masing komponennya oleh detektor. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan
oleh senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju detektor. Waktu retensi
dihitung dari saat sampel diinjeksikan hingga puncak pembacaan maksimum pada detektor.
Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu yang berbeda sehingga masing-masing
konsentrasinya dapat dihitung.

Kolom Silika dari Thermo Scientific

Kolom HPLC tersedia dalam panjang serta packing material yang berbeda-beda tergantung
dari jenis HPLC yang hendak digunakan. Packing material merupakan material yang diisikan
ke dalam kolom sebagai fase diam. Packing material yang sering digunakan biasanya yang
berbasis silika, baik silika yang tidak dimodifikasi maupun yang telah termodifikasi seperti
oktadesil silika (ODS) yang memiliki lapisan C18.

 
6. Detektor

Detektor UV-Vis

Alat ini berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang telah melewati kolom dan
memberikan sinyal elektronik pada pengolah data. Terdapat beberapa jenis detektor HPLC
tergantung dari karakteristik yang hendak dibaca. Misalnya pada detektor jenis UV-vis, maka
karakteristik yang dibaca oleh detektor adalah absorbansinya. Detektor jenis lain yang bisa
digunakan adalah detektor indeks bias, fluoresensi, serta detektor elektrokimia.

7. Pengolah Data

Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang terbaca oleh detektor dalam
bentuk kromatogram. Kromatogram menggambarkan jumlah komponen pada sampel dilihat
dari jumlah puncak (peak) yang dihasilkan. Konsentrasi komponen yang hendak dianalisis
dapat dihitung dengan membandingkan luas area peak komponen dengan luas area peak serta
konsentrasi standar.
 

Contoh kromatogram