RESUME ANALISIS FARMASI

Dosen Pengampu : Sugeng Supriyanto, M.S.Farm

Disusun Oleh :
KELOMPOK 9
Nama Nim Kontribusi
Ilham Hidayatul Latif 202205039 Halaman 7 - selesai
Inayatul Maftukhah 202205040 Halaman 1- 4
Tiara Aidahrahma 202205057 Halaman 5-7

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI PROGRAM SARJANA
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH GOMBONG
2024

1
 KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(KCKT)

KCKT disebut juga dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

KCKT merupakan Teknik pemmisahan untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu, dan dapat
digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
Kegunaan Umum KCKT :
1. Untuk pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik, maupun senyawa biologis
2. Analisis ketidakmurnian (impurities)
3. Analisis senyawa-senyawa tidak menguap (non-volatil)
4. Penentuan molekul-molekul netral,ionic, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa yang strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa dalam jumlah seklumit (trace elements), dalam jumlah banyak dan
dalam skala industri.
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika KCKT dihubungkan
dengan spectrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks,
maka resolusi yang baik sulit diperoleh.
Cara kerja KCKT
Zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu
kolom kromatografi.
Instrument KCKT terdiri atas 8 komponen pokok :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak
3. Alat untuk memasukan sampel,
4. Kolom,
5. Detektor,
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Computer/integrator/perekam.
Wadah fase gerak pada KCKT
- wadah harus bersih dan lembam (inert) -> biasanya dapat menampung 1-2 liter pelarut.
- Fase gerak sebelum di gunakan harus dilakkukan degassing (penghilangan gas) karena
adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama dipompa dan detector
sehingga akan mengacaukan analisis.

2
 - Syarat membuat pelarut untuk fase gerak : menggunakan pelarut, buffer, dan reagen dengan
kemurnian yang sangat tinggi.
Fase gerak pada KCKT
Fase gerak atau eluen terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang berperan dalam
daya elusi dan resolusi.
▪ Fase Normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak) : kemampuan elusi meningkat
dengan meningkatnya polaritas pelarut
▪ Fase terbalik ( fase diam kurang polar daripada fase gerak) : kemampuan elusi menurun
dengan meningkatnya pelarut.
Elusi dapat dilakukan dengan cara :
▪ Isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi)
▪ Bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi).
Fase gerak yang sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan
buffer dengan methanol atau campuran air ddengan asetonitril.
2 jenis pompa dalam KCKT :
▪ Pompa dengan tekanan konstan
▪ Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.-> umum digunakan.
Pada Fase Normal, fase gerak yang sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon
dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenis alkohol.
Pompa pada KCKT
2 jenis kolom pada KCKT yaitu : konvensional dan mikrobor.
Ada 3 keuntungan utama kolom mikrobor dibanding kolom konvensional yaitu :
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil disbanding kolom
konvensional.
2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat (10-100μ/menit) membuat kolom mikrobor lebih
ideal jika digabung dengan spectrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas missal sampel klinis.
Kekurangan kolom mikrobor : tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk
analisis rutin.
Fase diam pada KCKT
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silica yang dimodifikasi. Permukaan silica polar dan
sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

3
Silika yang dimodifikasi mempunyai karakteristik kromatografi dan selektifitas yang berbeda jika
dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi.
Solut-solut yang polar, terutama yang basa akan memberikan puncak yang mengekor (tailing peak)
pada penggunaan fase diam silika fase terikat yang disebabkan karena adanya interaksi absorbsi
antara solut-solut ini dengan residu silanol dan pengotor logam yang terdapatpada silika. ->
masalah ini dapat diatasi dengan end-capping yaitu proses menutup silanol dengan gugus
trimetilsili dan menggunakan silica dengan kemurnian yang tinggi (kandungan logam <1ppm)
Detektor KCKT
2 golongan detektor :
1. Detektor universal (mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) Co: detector indeks bias dan spektrofotometri massa
2. Detektor spesifik ( hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif) Co: detector UV-
Vis, detector fluorosensi, dan elektrokimmia.
Karakteristik ideal detector :
➢ Respon solute cepat dan reproduksibel.
➢ Sensitifitas tinggi
➢ Stabil dalam pengoperasiannya
➢ Mempunyai sel volume kecil
➢ Signal berbanding lurus dengan konsentrasi solute (kisaran dinamis linear)
➢ Tidak peka pada perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Detektor yang paling sering digunakan pada KCKT

1. Detektor Spektrofotometri UV-Vis

Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus gugas dan struktur-
struktur yang tidak jenuh. Adanya penyerapan ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada
kisaran panjang gelombang (90-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur-
struktur atau gügus gugus kromoforik. Mampu menghilangkan pengaruh indeks bias yang
dapat mengubah absorbansi yang terukur.
2. Detektor photodiode-array (PDA)
Detektor PDA merupakan detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor ini
mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang
yang berbeda. dalam sekali proses (single run) Selama proses berjalan, suatu kromatogram
pada panjang gelombang yang diinginkan (biasarnya antara 190-400) dapat ditampilkan.
3. Detektor Fluoresensi
Sensifitivitas sangat bagus selektif, tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir
fase gerak. Kelemahan detektor ini adalah terkait dengan rentang linieritasnya yang sempit

4
 yakni antara 10-100, sementara keunggulannya adalah bahwa detektor ini lebih sensitif dan
selektif.
4. Detektor indeks bias
Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang Sangat sensitif terhadap suhu,
dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien.
5. Detektor elektrokimia
Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada
elusi bergradien. Hanyamendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif
tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

Jenis-Jenis KCKT
1. Kromatografi Adsorbsi
Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
2. Kromatografi Partisi
Kromatografi jenis ini disebut juga dengan kromatografi fave terikat. Kebanyakan fase
diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat.
Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non
polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan
suatu fase gerak Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang
paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
4. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.

Derivatisasi pada KCKT

Detektor yang paling banyak digunakan dalam KCKT adalah detektor UV-Vis sehingga banyak
metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan
menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni produk yang
dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk
senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi
harus cepat dan mengha silkan produk yang sebesar mungkin (100%); produk hasil deriva- tisasi
harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak
menganggu pemisahan kromatografi.
Derivatisasi pada KCKT dapat dilakukan baik sebelum masuk ke kolom pre column derivafiration)
atau setelah kolom (post-col-umn derivatization).

5
Meskipun derivatisasi ditujukan untuk meningkatkan sifat kromatografi, akan tetapi di sini lebih
ditujukan untuk deteksi analit Uraian derivatisasi di sini akan didasarkan pada gugus fungsional
1. Asam karboksilat
Suatu reaksi derivatisasi yang umum bagi asam ini adalah pembentukan ester yang berasal
dari reaksi asam karbokosilat dengan pereaksi fenasil bromida.
2. Alkohol
Pembentukan ester juga banyak diterapkan pada derivatisasi alkohol. Derivat asam
karboksilat aktif seperti asil klorida merupa kan pereaksi yang banyak digunakan. Benzoil
klorida bereaksi dengan alkohol membentuk ester benzoat
3. Amina
Pembentukan amida yang melibatkan reaksi antara amina dengan asam karboksilat sama
dengan pembentukan ester bagi alkohol dengan asam karboksilat. Pembentukan amida ini
merupa kan reaksi unum bagi amina Pereaksi asilasi untuk alkohol juga digunakan untuk
derivatsasi amina. Selain itu, juga digunakan p-metoksibenzoil klorida sebagai bahan
asilasi gugus amina. Amina bereaksi dengan N-suksinil-p-nitrofenil membentuk pnitro-
fenilasetamida untuk membentuk derivat yang mempunyai kromofor.
4. Aldehida dan keton
Reaksi yang dikenal dengan penambahan nukleofil pada suatu ikatan rangkap karbon
heteroatom paling banyak digunakan untuk derivatisasi senyawa karbonil. Contoh reaksi
ini adalah kondensasi suatu keton dengan 2,4-dinitrofenilhidrazil (2,4-DNPH) membentuk
hidrazon yang mempunyai serapan molar lebih besar dari 10 pada 254 nm.

Derivatisasi pasca-kolom (setelah kalom)

Pada hakekatnya, reaksi yang telah disebut tadi dapat dimanfaatkan untuk derivatisasi
setelah-kolom. Pada cara ini, analit dikromatografikan sebagai bentuk belum direaksikan
kemudian diderivatisasi setelah keluar kolom akan tetapi belum mencapai detektor. Keuntungan
pendekatan ini adalah sifat kromatografis bahan dapat digunakan untuk pemisahan dan adanya
gangguan dari agen penderivat dapat dihindari. Kerugian utamanya adalah terjadinya sejumlah
pelebaran pita. Pada derivatisasi setelah-kolom, sanyawa mungkin dirusak dengan oksidasi,
reduksi dan lain-lain.

Penggunaan KCKT Dalam Analisis Farmasi

Metode ini meupakan metode aygn sangat populer untuk menetapkan kadar senyawa obat
baik dalam bentuk sediaan atau dalam sampel hayati. Hal ini disebabkan KCKT merupakan
metode yang memberikan sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi. Berkut adalah contoh
penggunaan KCKT untuk analisis beberapa sediaan farmasi diantaranya :

6
 Penggunaan metode KCKT untuk analisis
Obat Fase diam Fase gerak Detekstor
Adrenalis hidroksida C18 MeOG-bufer UV 280 nm
(injeksi) (380:620);bufer
disiapkan dari 7,8 g
natrium dosunat. pH
diatur 3,8 dengan
H3PO3.
Azaperon (injeksi) C18 CH3CN-bufer UV 243 nm
fosfat,pH diatur 7,8
Benzalkonium Siano , Zorbax H2O-THF- UV 215 nm
(perawatan mata) tratalonamin
(2500:1500:2)
Daunorubisin C18 H2O-CH3CN (62:38) UV 254 nm
(injeksi)
Ekonazol (serbuk) C18, Nova-pak MeOH-THF trieta- UV 230 nm
nolamin (0,1 pH
7,0)(70:12:18)
Fenilbutazon C18 Metanol-asam asetat UV 240 nm
(plasma,unrin,saliva, 2% (65:35)
keingat)
Guafenisin C18 Fosfar 10 UV 245 nm
(kapsul/eliksir) nM=MeOG-CH3CN
(8:2:1); pH diatur 5,5;
kecepatan air 1,2
mL/menit

------ selesai -----