Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT)

I. Tujuan Percobaan
Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat :
- Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
- Mengoperasikan alat kromatografi cair dengan baik dan benar
- Menganalisis suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif dengan
menggunakan alat kromatografi cair tekanan tinggi

II. Alat dan Bahan yang digunakan

- Alat yang digunakan
Seperangkat alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Syiringe
Penyaring milipone
- Bahan yang digunakan
Larutan standar Cafein
Metanol
Aquabidest

III. Dasar Teori

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk
analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

 Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-
komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan,
sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor
sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang
analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan
untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai
kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.
Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan
pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding
dengan fase terbalik.

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu
nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi
dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan,
dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan
tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak
yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
 Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom

konvensional, yakni:
- Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10 -100 μl/menit).
- Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
- Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika
yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika
adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti
klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya
dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah,
sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk
solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai
pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat
selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan
detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
 Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang
luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut :

Detektor Sensitifitas Kisaran Karakteristik

(g/ml) linier
Absorbansi Uv-
vis 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling
Fotometer filter 5 x 10-10 105 sering digunakan, selektif
Spektrofotometer > 2 x 10-10 105 terhadap gugus-gugus dan
spektrometer struktur-struktur yang
photo-diode tidak jenuh.
array
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,
selektif, Tidak peka
terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase
gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal
akan tetapi sensitivitasnya
sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak
dapat digunakan pada
elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan
Amperometri 10-12 105 suhu dan kecepatan alir
fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi
bergradien. Hanya
mendeteksi solut-solut
ionik. Sensitifitas sangat
bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan
adanya kontaminasi
elektroda.
JENIS HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non
polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering
kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam
dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun
demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada
silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.
Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat
terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH
sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami
ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan
ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk
spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air
karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya
air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air,
retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH
fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini
disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel
ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion.
Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
 5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat
fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi
terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah
molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak
melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian,
dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut
dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks.

DERIVATISASI PADA HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk
mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC
adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak
kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
4. Menstabilkan analit yang sensitif.

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga
banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor
yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga
dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu
berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.

Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk
yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat
membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri;
proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %);
produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa
pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.
 Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Gugus Reagen untuk dapat Reagen untuk dapat

fungsional dideteksi dengan UV-Vis
Asam-asam p-nitrobenzil-N,N’-
kaboksilat; diisopropilisourea
asam-asam (PNBDI); 3,5-
lemak;asam- dinitrobenzil-N,N’-
asam fosfat diisopropilisourea
(DNBDI); p-bromofenasil
bromida (PBPB)
Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC); 4-
dimetilaminiazobenzen-4-
sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-
naftilisosianat (NIC-1).
Aldehid; p-nitrobenziloksiamin
keton hidroklorida (PNBA); 3,5-
dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin
primer
Amin 3,5-dinitrobenzil klorida
primer (1o) (DNBC); N-suksinimidil-
dan p-nitrofenilasetat (SNPA);
sekunder N-suksinimidil-3,5-
(2o) dinitrofenilasetat
(SDNPA); 4-
dimetilaminiazobenzen-4-
sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-
naftilisosianat (NIC-1).
Asam-asam 4-dimetilaminiazobenzen-
amino 4-sulfinil (Dabsil-Cl)
(peptida)
dideteksi dengan
Fluoresen
4-bromometil-7-
asetoksikumarin;
4-bromometil-7-
metoksikumarin;
Dansil hidrazin
Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-
2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl); 7-fluoro-
4-nitrobenzo-2-oksa-
1,3-diazol (NBD-F);
Dansil klorida
Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-
2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl); 7-fluoro-
4-nitrobenzo-2-oksa-
1,3-diazol (NBD-F);

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization)
atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).
IV. Langkah Kerja
- Menyiapkan fase gerak yang akan digunakan untuk analisa dan memasukkan ke botol
fase gerak yang tersedia
- Memeriksa ketersediaan cairan seal wash pada pompa. Bila habis atau sudah lama
harap ditambah atau diganti dengan aquabidest baru
- Memasang kolom sesuai kebutuhan analisa (posisi panah kolom kearah bawah)
- Meyalakan instrumen : pompa, detektor (tombol power ada di belakang instrumen)
- Menyalakan CPU computer dan monitor
- Mengaktifkan server monitor pada pojok kanan bawah layar monitor
- Membuka software chromeleon 6.8
- Membuka panel instrumen : (bila ada warning tekan ok)
- Melakukan koneksi software dengan instrumen dengan memberi tanda ceklist pada
pump dan detector
- Melakukan purging pada channel fase gerak yang akan digunkan :
1. Membuka knob purging pada pompa
2. Mengatur prosentasi pompa
3. Mengklik purge pada software
4. Bila selesai purging jangan lupa tutup kembali knob purgenya
- Mengalirkan kolom dengan fase gerak yang diinginkan dengan flow 1 ml/menit
- Menyalakan lampu UV/VIS pada detektor sesuai kebutuhan analisa
- Membiarkan kolom teraliri fase gerak selama 30-60 menit
- Memindahkan window software ke posisi browser
- Membuat sequence : mengklik new sequence OK next
- Membuat program ;
1. Mengklik New Program File OK
2. Mengklik My computer HPLC Next
3. Memasukkan konsentrasi fase gerak yang diinginkan dan flowrate yang
digunakan, Next
4. Memasukkan waktu Runtime setiap injek Next
5. Memasukkan panjang gelombang yang diinginkan Next
6. Lalu disimpan, File Beri nama Save
- Membuat kuantitasi Data HPLC :
1. Pada window browser double klik salah satu standart
2. Akan muncul hasil data UV VIS 1 lalu klik QNT-Edtor
3. Mengklik General, memasukkan dimensi of amounts mis: ppm
4. Mengklik Detection melakukan pengaturan area : 0,1
5. Mengklik peak table mengarahkan panah ke tengah peak isi nama
zat
6. Mengklik amount table memasukkan amount konsentrasi standart,mis: 15
ppm
7. Mengklik save
8. Mengklik printer layout
9. Mengklik print
- Membuat sequence, instrumen method (program) dan prossesing data (rincian ada
pada bagian selanjutnya)
- Bila sequence, program dan proses method telah dibuat, klik batch start
- Mengklik ready check untuk memastikan sequence telah siap running, lalu start
- Melakukan injeksi standart dan sample
Cat : bila ingin menginjek sample, posisi injector ada pada posisi LOAD (atas). Bila
sudah ada warning waiting for injection, lalu putar injector ke posisi INJECT
- Menutup program :
1. Mengklik silang kecil
2. Mengklik stop batch
3. Mengklik immediatly OK
4. Mengklik silang kecil
5. Mematikan UV lamp
6. Pada pump mengklik stop flow
7. Pada home, uncek pump dan detector
8. Mengklik silang kecil silang besar
9. Pada chromeleon server monitor klik stop
10. Mematikan komputer dan HPLC

Analisa Data
Pada praktikum kali ini, kami melakukan praktikum kromatografi cair kinerja
tinggi. Pada kali ini dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif terhadap tablet
paracetamol dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Analisis ini bertujuan
untuk mengetahui mutu sediaan dari tablet paracetamol. Prinsip kerja KCKT adalah
pemisahan suhu senyawa berdasarkan sifat kepolarannya. System yang digunakan pada
percobaan ini yaitu fase balik, dimana fase diam yang digunakan bersifat non polar
sedangkan fse geraknya bersifat polar.
Pengujian tablet paracetamol diawali dengan penginjeksian sampel uji. Dengan
bantuan pompa bertekanan tinggi, sampel masuk kedalam kolom. Didalam kolom,
komponen-komponen sampel dipisahkan berdasarkan kepolarannya. Paracetamol yang
bersifat polar akan keluar terlebih dahulu Bersama fase gerak, dan eksipien lain yang
bersifat non polar akan tertahan adalah kolom.

Kesimpulan
Dari percobaan yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa KCKT adalah
instrument untuk pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik maupun senyawa
biologis, analisis ketidak murnian (impurines) dan analisis senyawa-senyawa yang tidak
mudah menguap.

Daftar Pustaka
 Tim Penyusun Laboratorium. Panduan Praktikum “Kimia Analitik Instrumen”.
Kromatografi cair kinerja tinggi.Politeknik Negeri Sriwijaya
https://arnisfarida.wordpress.com/tag/kromatografi-cair-kinerja-tinggi/
http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

Gambar Alat

Seperangkat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi