Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (KCKT)
KCKT / HPLC
 High Performance Liquid Chromatography
 Dikembangkan akhir th 1960-an dan awal 1970-an
 Teknik pemisahan yg diterima secara luas utk analisis dan pemurnian
 Merupakan metode yg non-destruktif, dpt digunkan utk uji kualitatif
maupun kuantitatif
 Kegunaan umum : pemisahan sejumlah senyawa organik dan
anorganik, senyawa biologis, analisis impurities, analisis senyawa yg
tidak mudah menguap (non-volatil), penentuan molekul netral, ionik,
zwitter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa yg
strukturnya hampir sama, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan
senyawa dalam jumlah sekelumit, dalam jumlah banyak dan dalam
skala industri
Cara kerja KCKT

 Teknik dimana solut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi,

dikarenakan solut melewati kolom kromatografi
 Pemisahan solut diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan
fase diam
 Perlu kombinasi tepat dari berbagai macam kondisi operasional
spt: jenis kolom, fase gerak, panjang dan diameter kolom,
kecepatan aliran fase gerak, suhu kolom dan ukuran sampel
Ilustrasi kerja HPLC
Instrumentasi KCKT

Gbr instrumentasi HPLC

Wadah fase gerak

 Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert)

 Wadah biasanya dapat menampung 1liter-2 liter pelarut
 Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan
degassing
 Pada sat membuat pelarut utk fase gerak sangat
dianjurkan menggunkan pelarut, buffer dan reagen yg
pro HPLC
Fase gerak KCKT

 Eluen terdiri dari campuran pelarut yg dapat bercampur yg secara

keseluruhan berperan dalam aya elusi dan resolusi
 Polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, sifat komponen
sampel
 Pada Normal phase (fase diam lebih polar dari fase gerak) elusi
meningkat dg meningkatnya polaritas pelarut
 Pada reverse phase (fase terbalik)  kemampuan elusi menurun dg
meningkatnya polaritas pelarut
 Elusi dapat dilakukan dg cara:
 Isokratik : komposisi fase gerak tetap selama elusi
 Gradien : komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi 
digunakan utk meningkatkan resolusi campuran yg kompleks,
terutama jika sampel memiliki kisaran polaritas yg luas
 Fase gerak yg sering digunkan utk fase terbalik : campuran buffer
dg metanol atau campuran air dg asetonitril
 Untuk fase normal fase gerak yg sering digunkan adalah campurab
pelarut-pelarut hidrokarbon dg pelarut yg terklorisasi atau
menggunkan pelarut jenis alkohol
Deret eluotropik pelarut-pelarut KCKT
Pompa pada KCKT

 Harus inert terhadap fase gerak

 Bahan yg umum dilpakai : gelas, baja tahan karat, teflon dan batu
nilam
 Pompa mampu memberikan tekanan samapi 5000psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dg kecepatan alir 3ml/menit
 Utk tujuan preparatif, pompa harus mampu mengalirkan fase gerak
dg kecepatan 20ml/menit
 Fungsi pompa adalah menjamin proses penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan dan bebas dari
gangguan
Penyuntikan sampel pada KCKT

 Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam

fase gerak yg mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan
alat penyuntik yg terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yg
dilengkapi dengan sample loop internal atau eksternal

Gbr skema sample loop

Kolom pada KCKT

 Kolom konvensioanl
 Kolom mikrobor
 Konsumsi fase gerak hanya 80%, karena kecepatan aliran fase
gerak lebih lambat
 Lebih ideal jika digabung dg spektrofotometer massa
 Sensitivitas ditingkatka karena solut lebih pekat  bermanfaat
jika jumlah sampel terbatas
 Tidak stahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat utk
analisis rutin
Perbandingan kolom konvensioanl dan mikrobor
Fase diam pada KCKT

 Berupa silika yg dimodifikasi secara kimiawi, silika yg tidak dimodi atau

polimer stiren dan divinil benzen

Gambar silika fase terikat

 Oktadesil silik (ODS atau C18) paling banyak digunakan  mampu
memisahkan senyawa dg kepolaran yg rendah, sedang maupun tinggi
 Oktil lebih sesuai utk senyawa yg polar
 Silika aminopropil dan sianopropopil lebih cocok sbg penggnanti silika yg
tidak dimodif
 Silika yg tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yg bervariasi
karena aanya kandungan air
 Solut yg polar  tailing peak  end capping
Detektor KCKT
 Detektor universal (mendeteksi secara umum, tidak spesifik an tidak
selektif, ex: detektor indeks bias, detektor spektrometri massa)
 Detektor spesifik (hanya mendeteksi analit secara selektif dan
spesifik)
 Karakteristik detektor ideal :
 Respon thd solut cepat dan reprodusibel
 Sensitifitas tinggi
 Stabil dalam pengoperasian
 Mempunyai sel volume kecil minimalisir pelebaran pita
 Signal yg dihasilkan berbandding lurus dg konsentrasi solut pd
kisaran yg luas
 Tidak peka thd perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
 Detektor spektrofotometri UV-Vis
 Detektor yg digunakan utk senyawa yg dapat menyerap sinar
UV-Vis
 Detektor PDA (photo-diode array)
 Mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan
pd pjg gelombang yg berbeda dalam single run
 Detektor fluorosensi
 Utk senyawa-senyawa berfluoresens
 Detektor indeks bias
 Bersifat universal, mersepon stiap perbedaan indeks bias antara
analit dg pelarut  utk senyawa yg tidak berkromofor
 Detektor elektrokimia
 Utk senyawa organik yg dpt dioksidasi atau direduksi scr
elektrokimia
Komputer, integrator atau rekorder

 Alat pngumpul data yg dihubungkan dg detektor

 Mengukur sinyal elektronik yg dihasilkan oleh detektor
di plot kan dalam bentuk kromatogram
Jenis-jenis kromatografi

Kromatografi adsorpsi

Kromatogarfi partisi

Kromatografi penukar ion

Kromatografi eksklusi ukuran

Kromatografi adsorpsi
 Fase normal dg menggunakan fase diam silika gel dan
alumina
 Fase gerak yg digunakan berupa pelarut nonpolar yg
ditambah pelarut polar atau alkohol rantai pendek
 Penambahan pelarut harus dipertimbangkan matang 
terlalu sedikit belum mmp mengelusi solut, terlalu bnyk
dpt menyebabkan kolom kurang aktif
 Air yg ada di fase gerak dan penjerap harus konstan 
agar waktu retensi reprodusibel
 Jenis ini kurang luas penggunaannya, namun dpt
digunakan utk pemisahan campuran isomer struktur dan
utk pemisahan solut dg gugus fungsional yg berbeda
Kromatografi partis

 Disebut juga kromatografi fase terikatfase diam adalah

silika yg dimodif secara kimiawi atau terikt (
hidrokarbon2 nonpolar seperti oktadesilsilana,
oktasialana atau fenil)
 Fase diam yg paling populer ODS , reversed phase
 Fase gerak yg digunakan campurab metanol atau
asetonitril dg air tau buffer
Kromatografi penukar ion

 Menggunakan fase diam yg dapat menukar kation atau anion dg

suatu fase gerak
 Paling sering digunakan polistiren resin
 Kebanyakan menggunakan media air
 Jenis ion dlm fase gerak dpt berpengaruh secara nyata pada
retensi solut
 Urutan retensi anion: sitrat> sulfat> oksalat> iodida> nitrat> kromat>
bromida> sianida> klorida> format> asetat> hidroksida> fluorida
 Urutan retensi kation : Ba2+> Pb2+> Sr2+> Ca2+> Ni2+> Cd2+>
Cu2+> Co2+> Zn2+> Mg2+> UO2+> Te2+> Ag+> Cs+> Rb+> K+>
NH4+>Na+> H+> Li+
Kromatografi eksklusi ukuran

 Disebut juga kromatografi permeasi gel

 Dapat digunakan utk analisis senyawa dg berat molekul
> 2000 dalton
 Fase diam dpt berupa silika atau polimer yg bersifat
porus
 Miolekul solut yg memiliki BM lebih besar akan terelusi
lebih dahulu
 Fase diam yg digunakan sphadex, biogel, agarosa,
stiragel
Derivatisasi pada KCKT

Pre column derivatization

• Analit diderivatisasi lebih dahulu

Post column derivatization

• Analit diinjeksikan dahulu ke kolom lalu
diderivatisasi setelah keluar kolom sebelum
mencapai detektor