KCKT

Kromatorafi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT merupakan teknik

pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel yang
dikembangkan pada tahun 1960-1970an. KCKT merupakan
metode yang tidak destruktif ddan dapat digunakan untuk
analisis kualitatif atau kuantitatif
Kegunaan
 Pemisahan sejumlah senyawaa organik, anorganik ataupun biologis
 Analisis ketidakmurnian
 Analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap
 Penentuan molekul-molekul netral, ionik atau zwitter ion
 Pemurnian senyawa
 Pemisahan senyawa yang strukturnya mirip
 Pemisahan senyawa dalam jumlah sekelumit, banyak, bahkan dalam
jumlah industri
Keterbatasan
 Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi
senyawa kecuali jika KCKT dihubungkan dengan
spektrometer massa
 Jika sampernya sangat kompleks, maka resolusi yang baik
sulit diperoleh
Instrumentasi KCKT

 Wadah fase gerak

 Sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan
sampel
 Kolom,
 Detektor,
 Wadah penampung buangan fase gerak,
 Tabung penghubung, dan
 Komputer atau integrator atau perekam.  
Diagram Blok
Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel. Untuk fase normal, kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik,
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Wadah Fase Gerak KCKT
Wadah fase gerak harus dalam keadaan bersih dan lembam.
Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat
digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase
gerak sebelum digunakan harus dilakukan penghilangan gas,
sebab adanya gas akan mengacaukan analisis.
Pelarut Fase Gerak
Pada saat membuat pelarut untuk fase gerak, maka sangat
dianjurkan untuk menggunakan pelarut, bufer, dan reagen
dengan kemurnian yang sangat tinggi, dan lebih terpilih lagi
jika pelarut-pelarut yang akan digunakan untuk KCKT
berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam
reagen dapat menyebabkan gangguan pada sistem
kromatografi.
Elusi
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase
gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien
(komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi). fase gerak
yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau
Campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan
fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
Pompa KCKT
Syarat Pompa
 Pompa harus inert terhadapt fase gerak
 Berbahan dasar gelas, baja tahan karat, teflon dan batu nilam
 Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi
 Mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir
3ml/menit (untuk tujuan preparatif kecepatan minimalnya
adalah 20ml/menit)
Tujuan
Tujuan penggunaan pompa adalah
untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak
berlangsung secara tepat,
reprodusibel, dan konstan.
Jenis
Jenis pompa KCKT dibagi
menjadi dua, yaitu pompa derngan
tekanan konstan, dan pompa
dengan aliran fase gerak yang
konstan.
Pengisian Sampel
Pada saat pengisian sampel, sampel digelontor melewati keluk
sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat
penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir
melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom.
Presisi penyutik dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai
RSLD 0,1%. Penyuntik ini mudah digunakan untuk
otomatisasi dan sering gunakan untuk autosampler pada
KCKT.
 Kolom Pada KCKT
Kolom Konvensional Kolom Mikrobor
Parameter

Stanless steel Stanless steel

Panjang 3, 10, 15, 20 dan 25 Cm. Panjang 25 dan 50 cm
Tabung kolom
Diameter luar 0,25 inci Diameter luar 0,25 inci
Diameter dalam 4,6 mm. Diameter dalam 1 atau 2 mm.

Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodifikasi secara kimiawi (bonded plhase), atau polimer-polimer stiren/divinil Porous, silika ukuran kecil, silika yang dimodifikasi secara kimiawi (bonded plhase), atau polimer-polimer
Fase diam benzen. stiren/divinil benzen.
Rata-rata diameter partikel 3,5, atau 10 μm dengan kisaran ukuran partikel yang sempit. Rata-rata diameter partikel 3,5, atau 10 μm dengan kisaran ukuran partikel yang sempit.

Tekanan 500-3000 psi 1000 5000 psi

operasional (35-215 bar) (70-350 bar).

Hidrokarbon+ pelarut-pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase)
digunakan metanol atau asetonitrilt air atau buffer.
Hidrokarbon+ pelarut-pelarut terklorinasi atau alkohol untuk fase normal. Untuk fase terbalik (reversed phase) digunakan
Kecepatan alir: 10-100 μl/menit.
Fase gerak metanol atau asetonitrilt air atau buffer.
Modifikast instrumen
Kecepatan alir: 1-3 ml/menit.
Sistem penghantaran pelarut yang mampu memberikan kontrol aliran di bawah 10 μl/mernit. Katup injeksi sampel
bervolume keci, Sel detektor bervolume kecil

Efisiensi meningkat dengan berkurangnya ukuran partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dengan ukuran partikel 3 pm Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi lambat.
Kinerja
lebih pendek. Konsumsi fase gerak hanya 1/4 dari kolom konvensional
Keuntungan Kolom Mikrobor
 Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvesional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase
gerak lebih lambat (10-100μl/menit)
 Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa
 Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya
jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Walaupun begitu, kolom mikrobor tidak setahan kolom konvensional dan kurang
bermanfaat untuk analisis rutin
Fase Diam KCKT
Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen.
Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karen adanya residu gugus silanol.
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen
seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan
menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Silika yang dimodifikasi
ini mempunyai karakteristik kromatografik dan selektifitas yang berbeda jika
dibandingkan dengan silika yang tidak dimodifikasi. Oktadesil silika merupakan
fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-
senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Silika yang tidak
dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena
adanya kandungan air yang digunakan.
Fase diam eksklusi dan penukar ion dapat menggunakan silika
atau polimer. Asam sulfonat merupakan fase diam dengan
mekanisme penukar kation, sementara anonium kuartener
mempunyai mekanisme penukar anion. Fase diam kiral telah
dikembangkan untuk memisahkan campuran enansiomer, akan
tetapi jenis fase diam ini mahal dan mempunyai waktu hidup
yang pendek
Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan
yaitu: detektor universal (mendeteksi zat secara umum) seperti
detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan
golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi
analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis,
detektor fluorosensi, dan elektrokimia.
Karakteristik Detektor
 Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
 Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil
 Stabil dalam pengoperasiannya
 Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita. Untuk kolom konvensional, selnya bervolume 8 μl atau lebih kecil,
sementara kolom mikrobor selnya berukuran 1 μl atau lebih kecil lagi.
 Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier)
 Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Detektor Spektoforometri UV-Vis
Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan
dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakan
senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis.
Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi ultraviolet
(UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang 190-800
nm. Sel detektor umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan
panjang celah optiknya 10 mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga
mampu menghilangkan pengaruh indeks bias yang dapat mengubah
absorbansi yang terukur.
Detektor Photodiode-Array (PDA)
Detektor ini mampu memberikan kumpulan kromatogram
secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam
sekali proses. selama proses berjalan, suatu kromatogram pada
panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190-400)
dapat ditampilkan. Dan dengan detektor ini pula, dapat
dilakukan uji kemurnian puncak dengan membandingkan
antara spektra analit dengan spektra senyawa yang sudah
diketahui.
Detektor Fluorosensi
Fluorosensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi
ketika suatu senyawa menyerap sinar UV atau visibel lalu
mengemisikannya pada panjang gelombang yang lebih besar.
Tidak semua senyawa obat mempunyai sifat fluorosen
sehingga detektor fluorosensi ini sangat spesifik. Kelemahan
detektor ini adalah terkait dengan rentang linieritasnya yang
sempit yakni antara 10-100, sementara keunggulannya adalah
bahwa detektor ini lebih sensitif dan selektif.
Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang bersifat universal yang
mampu memberikan respon (signal) pada setiap zat terlarut. Fase gerak
yang digunakan ketika menggunakan detektor ini harus mengandung
elektrolit pendukung sehingga fase geraknya harus yang bersifat polar.
Keuntungan detektor ini yaitu memiliki kepekaan yang tinggi
.Sementara kelemahan detektor adalah membutuhkan keterampilan dan
latihan yang cukup untuk mengoperasikannya supaya didapatkan garis
dasar (baseline) yang stabil. Selain itu, terdapat alat pengumpul data
yaitu computer, integrator ataurekorder yang dihubungkan pada detector
akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detector lalu
mem-plotkannnya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat
dievaluasi oleh seorang analisis.
Jenis-Jenis KCKT
Kromatografi Adsoprsi
Pemisahan kromatografi adsorbs biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina. Fasegerak yang digunakan untuk
fase diam silika atau alumina berupa pelarut non-polar yang ditambah dengan
pelarut polar seperti air atau alcohol rantai pendek. Penambahan air atau pelarut
polar lain harus dipertimbangkan secaramatang karena jika terlalu sedikit yang
ditambahkan maka kemungkinan belum mampu mengelusi solute, sementara jika
terlalu banyak akan menyebabkan kolom menjadi kurang aktif. Pemilihan fase
gerak pada kromatografi adsorpsi ini terbatas jika detektor yang digunakan adalah
spektrofotometer UV. Jenis KCKT ini kurang luas penggunannya, meskipun
demikian jenis KCKT ini sesuai untuk pemisahan-pemisahan campuran isomer
struktur dan untuk pemisahan solute dengan gugus fungsional yang berbeda.
Kromatografi Partisi
Kromatografi jenis ini disebut dengan kromatografi fase
terikat. Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika
yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Disini
peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak
diatur maka solute akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Kromatografi Penukar Ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi
puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionic serta pH
fase gerak. Jenis ion dalam fase gerak dapat berpengaruh secara nyata
pada retensi sebagai akibat dari perbedaan kemampuan ion fase gerak
berinteraksi dengan resin penukar ion. Urutan retensi dari berbagai
anion untuk resin penukar anion polistirena berikatan silang
konvensional adalah sebagai berikut : sitrat > sulfat > oksalat > iodide >
nitrat > kromat > bromida > sianida > klorida > format > asetat >
hidroksida > fluoride.
Kromatografi Eklsusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi
gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis
senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang
digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus
sehingga solute dapat melewati porus atau berdifusi lewat fase
diam. Dua tipe bahan sebagai fase diam yang digunakan dalam
kromatografi ini ialah gel dari senyawa organik (polimer), dan
silika gel yang mudah berinteraksi dengan polimer.
Fase Diam yang Dapat Digunakan untuk
Kromatografi
• Sphadex, digunakan untuk pemisahan protein. Bahan disintesis dari
polisakarida seperi dekstran.
• Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-gel P, yang dibuat
dengan kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N’ metil-bis-akrilamid.
• Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa, diberi nama Bio-Gel A.
terbuat dari polgalaktopiranosa, agak lunak dan tidak tahan tekanan tinggi.
• Stiragel, pemisahan senyawa yang tidak larut dalam air dan menggelembung
pada pelarut organic.
Derivatisasi pada KCKT
Detektor yang paling banyak digunakan dalam KCKT adalah
detector UV-Vis sehingga banyak mode yang dikembangkan
untuk memasang atau menambahkan gugus kromotof yang
akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu.
Derivatisasi pada KCKT dapat dilakukan baik sebelum masuk
ke kolom atau setelah kolom. Pada sebelum kolom, analit
diderivatisasi lebih dulu sebelum diinjeksikan ke dalam
kromatografi, sementara itu pada derivatisasi setelah kolom,
analit diinjeksikan dahulu kepada kolom lalu diderivatisasi
setelah keluar dari kolom.
Uraian Derivatisasi
Asam Karboksilat
Suatu reaksi derivatisasi yang umum bagi asam ini adalah
pembentukan ester yang berasal dari reaksi asam karboksilat
dengan pereaksi fenasil bromide menurut reaksi
Sebagai katalis ditambahkan triaalkilamina untuk menggeser reaksi ke
kanan dengan menampung HBr hasil reaksi tersebut. Agen penderivat ο-
p-nitrobenzil-N,N’-diisopropilisourea (PBDI) bereaksi dengan asam
karboksilat membentuk ester p-nitrobenzil menurut reaksi sebagai
berikut
Alkohol
Derivat asam karboksilat aktif seperti asil klorida merupakan pereaksi
yang banyak digunakan. Benzoil klorida bereaksi dengan allkohol
membentuk ester benzoate menurut reaksi berikut

Meskipun demikian reaksi ini menghasilkan serapan molar yang terlalu

rendah untuk dianalisis, sehingga digunakan agen penderivat lain seperti
p-nitrobenzoil-,3,5-dinitrobenzoil- dan densil klorida.
Amina
Pereaksi asilasi untuk alcohol juga digunakan untuk derivatisasi amina. Selain itu, juga digunakan p-
metoksibenzoil klorida sebagai bahan asilasi gugus amina. Amina bereaksi dengan N-suksinil-p-
nitrofenil membentuk p-nitro-fenilasetamida, menurut reaksi

Reaksi klasik amina dengan 2,4-dinitro-1-flourobenzen member hasil yang menyerap cahaya pada
360 nm. Reaksi ini digunakan unruk analisis tobramisin dalam serum
Dansil klorida (5-N,N-dimetilaminonaftalen-2-sulfonil klorida) bereaksi dngan
amina primer dan sekunder membentuk turunan sulfonamide yang mampu
berfluoresensi sehingga bisa dideteksi dengan spektroflourometri. Frnol juga
member akses yang serupa dengan dansil klorida ini.

Amina primer bereaksi dengan orto-ftalaldehida memberi hasil yang berflourensi

tinggi. Hasil reaksi ini menyangkut kondensasi dengan membentuk cincin dengan
adanya 2-merkaptoetanol.
Aldehida dan Keton
Reaksi yang dikenal dengan penambahan nukleofil pada suatu ikatan rangkap
karbon heteroatom paling banyak digunakan untuk derivatisasi senyawa karbonil.
Karbonil juga bereaksi dengan p-nitrobenziloksiamina membentuk suatu oksim
yang juga berguna bagi KCKT. Pada cara ini, analit dikromatografikan sebagai
bentuk belum direaksikan kemudian diderivatisasi setelah keluar kolom akan tetapi
belum mencapai detektor. Keuntungan pendekatan ini ialah sifat kromatografis
bahan dapat digunakan untuk pemisahan dan adanya gangguan dari agen perderivat
dapat di hindari. Kerugian utamanya adalah terjadinya pelebaran sejumlah pita.
Pada derivatisasi seelah-kolom, senyawa mungkin dirusak dengan oksidasi, reduksi
dan lain-lain.
Penggunaan KCKT dalam Analisis Farmasi
Metode KCKT merupakan metode yang sangat populer untuk
menetapkan kadar senyawa obat baik dalam bentuk sediaan
atau dalam sampel hayati. Hal ini disebabkan KCKT
merupakan metode yang memberikan sensitifitas dan spesifitas
yang tinggi.
Terima Kasih