Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT)
Apt. Wahyu Rohmatin Nikmah, S.Farm
Kromatografi

 Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas
permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang
stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa gerak dapat berbentuk
cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-
padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-cair (Day dan Underwood, 2002).
 Kromatografi menerapkan prinsip tingkat lanjut dari proses ekstraksi. Ekstraksi adalah suatu metode untuk
memisahkan suatu komponen dalam suatu cairan atau padatan dengan cairan lain yang tidak saling
bercampur, sehingga komponen tersebut berpindah kedalam cairan kedua (Ismail&Arifin, 2011).
Macam-macam Kromatografi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi(KCKT)

 Metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dipilih sebagai metode analisis yang digunakan karena
metode ini telah diketahui merupakan suatu teknik analisis yang cepat, dapat memisahkan campuran menjadi
komponen-komponen tunggalnya dengan spesifisitas dan ketelitian yang tinggi. Metode ini dapat
sepenuhnya diotomatisasi dan merupakan metode yang umum digunakan untuk analisis kualitatif maupun
kuantitatif dalam teknologi industri pangan (Lee dan Shang, 2008).
 Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan salah satu metode pemisahan yang memanfaatkan teknologi
dalam proses pemisahan suatu senyawa campuran atau suatu analit.
Komponen dalam KCKT

Fase Diam Fase Gerak Instrument

Solvent
Kolom Injector
(pelarut)

Pompa

Detector
Komponen dalam KCKT

A. Pompa (Pump)
 Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang
digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement).
Beberapa persyaratan sistem pompa KCKT adalah :
 Memberi tekanan sampai 6000 psi
 Sama sekali bebas dari pulsa
 Memberikan kecepatan aliran 0,1 – 10 ml/ menit
 Alirannya terkontrol dengan reprodusibilitas 0,5% atau kurang (lebih baik)
 Antikarat, oleh sebab itu seal pompa terbuat dari bahan baja atau teflon
 Sistem pompa KCKT yang baik harus dapat melaksanakan sistem elusi dari isokratik yang sederhana sampai
sistem elusi dengan pemompaan otomatis yang sempurna misalnya sampai pada gradient terner / gradient
quarterner.
 Sistem Elusi Isokratik
Pada sistem ini elusi dilakukan dengan satu macam
larutan pengembang atau lebih dari satu macam larutan
pengembang (pelarut pengembang campur) dengan
perbandingan yang tetap, misalnya metanol–air = 50 : 50
v/v
Sistem Elusi Gradient
Pada sistem ini elusi dilakukan dengan pelarut
pengembang campur yang perbandingannya berubah
dalam waktu tertentu, misalnya metanol – air = 40 : 60
v/v ; dengan kenaikan kadar metanol 8% setiap menit
(Mulja dan Suharman, 1995). Elusi Gradien
didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak
selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari
Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari
senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom
B. Injektor (injector)
Injektor memakai
Sistem dengan pipa dosis saat ini merupakan pilihan yang
paling tepat pada KCKT khususnya untuk analisis kuantitatif.
diafragma (septum)

Injektor
Sebab ketepatan jumlah volume sampel yang diinjeksikan
akan sangat penting untuk analisis  kuantitatif dan keadaan ini
hanya dapat diantisipasi dengan injektor sistem pipa dosis injektor tanpa septum
(sampel loop). Prinsip kerja dari pipa dosis adalah load inject,
ini berarti pada keadaan pertama sampel akan masuk loop dan
akhirnya dengan volume yang tidak berkurang sedikitpun
injektor  dengan pipa
segera masuk menuju kolom pemisahan
dosis
C.  Kolom (Column)
      Kolom kromatografi cair kinerja tinggi dapat
terbuat dari bahan metal antikorosif dan tahan
zat kimia, bahan gelas tahan zat kimia atau
bahan gelas yang dilapisi bahan metal (Mulja
dan Suharman, 1995).
Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua
kelompok, yaitu :
 Kolom analitik : Diameter dalam 2 - 6 mm.
Panjang kolom tergantung pada jenis material
pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular,
panjang yang digunakan adalah 50 - 100 cm.
Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 - 30
cm, dewasa ini ada yang 5 cm.
 Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter
6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -
100 cm ( Putra, 2004 ).
KCKT berdasarkan Fasa diam dan Fasa gerak
Kromatografi fase normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase
diamnya normal bersifat polar, misalnya silika gel,
sedangkan fase geraknya bersifat nonpolar
Kolom fase terbalik
Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya
bersifat nonpolar sedangkan fase geraknya bersifat
polar, kebalikan dari fase normal. Fase diam nonpolar
yang paling banyak digunakan adalah jenis C18, C8,
dan  C2
D. Detektor (Detector)

 Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat
digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga
digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika
dibandingkan dengan detektor UV (Putra, 2004).
 Syarat 1. Murni, tidak terdapat kontaminan
Fase
2. Fase Gerak Gerak 2. Tidak bereaksi dengan wadah
(packing)
3. Sesuai dengan detektor

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas 4. Melarutkan sampel

campuran pelarut yang dapat bercampur
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi
dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini
ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, 5. Memiliki viskositas rendah
polaritas fase diam, dan sifat komponen-
komponen sampel.

6. Bila diperlukan, memudahkan

"sample recovery"
 Untuk sampel normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak yang paling sering digunakan
untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan methanol atau campuran air
dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah
campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut
jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik
Penggunaan KCKT

Kombinasi kromatografi cair tekanan tinggi (KCKT) dengan pemantauan melalui deteksi UV/visible memberikan
suatu metode yang akurat, tepat dan terandalkan untuk analisis kuantitatif produk-produk farmasi dan merupakan
metode standar di industri untuk tujuan ini.

Pemantauan stabilitas zat-zat obat murni dan obat-obat dalam formulasi, dengan pengukuran kuantitas semua
hasil urai.

Pengukuran obat-obat dan metabolitnya dalam cairan biologis.

Penentuan koefisien partisi dan nilai pKa obat dan penentuan ikatan protein obat
Kelebihan dan
Kekurangan
metode KCKT
Kelebihan metode KCKT adalah:

 Pemasukan sampel yang tepat dan mudah dikendalikan menjamin presisi kuantitatif.
 KCKT adalah teknik kromatografi yang perkembangannya tampak paling intensif beberapa tahun
belakangan, memberikan perbaikan pada pengendalian kolom, detektor, dan piranti lunak.
 Keragaman kolom dan detektor berarti bahwa selektivitas metode tersebut dapat disesuaikan dengan mudah.
 Dibandingkan dengan KG, terdapat risiko peruraian sampel yang lebih kecil karena pemanasan bukan
merupakan syarat dalam proses kromatografi.
 Mudah diotomatisasi
Kekurangan Metode KCKT adalah

 Masih dibutuhkan detektor yang terandalkan dan tidak mahal yang dapat memantau senyawa-senyawa yang
tidak memiliki kromofor.
 Obat-obat harus diekstraksi dari formulasinya sebelum dianalisis.
 Terbentuknya buangan pelarut organik dalam jumlah besar, yang mahal jika dibuang
Aplikasi KCKT
Instrument KCKT