TUGAS ANALISIS FARMASI

RANGKUMAN KLT DENSITOMETRI

OLEH :

NAMA : FIRDA YANTI

NIM : O1A118241

KELAS : D

DOSEN PENGAMPU : Apt. NURULL HIKMAH, S.Farm., M., Pharm.Sci.

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2022
 PEMBAHASAN

Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering digunakan
dalam bidang kimia analisis dan dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis, baik analisis
kualitatif, kuantitatif, atau preparative dalam bidang farmasi. Kromatografi merupakan suatu Teknik
pemisahan yang menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak (mobile phase). KLT
merupakan salah satu metode isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap (adsorpsi) dan
daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti
kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka
komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan
pemisahan. Adapun beberapa jenis sistem kromatografi diantaranya adalah ; Kromatografi kertas,
kromatografi lapisan tipis ( Thin Layer Chromatography ), kromatografi gas ( Gas Chromatography ),
dan kromatografi cair kinerja tinggi ( High Performance Liquid Chromatography ). Analisis kualitatif
dapat dilihat dengan membandingkan nilai Faktor Reterdasi (Rf) analit dengan nilai Faktor Reterdasi
(Rf) standar. Deteksi tersebut dilakukan dengan cara menscanning bercak dengan sumber cahaya
dalam bentuk celah atau slit yang dapat dipilih baik panjang gelombang maupun lebarnya.

Kromatografi lapis tipis merupakan jenis kromatografi yang dapat digunakan untuk
menganalisis senyawa secara kualitatif maupun kuantitatif. Lapisan yang memisahkan terdiri atas
bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan
yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita,
setelah pelat/lapisan ditaruh dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang
cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi setelah perambatan kapiler (pengembangan), selanjutnya
senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan/dideteksi. Deteksi dilakukan dengan
menggunakan sinar UV. Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel.

 Prinsip dan Cara Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Pada dasarnya KLT digunakan untuk memisahkan komponen-komponen berdasarkan

perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam di bawah gerakan pelarut pengembang. KLT sangat
mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyata terlihat
pada fase diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai
pengganti kertas. Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan
kesetimbangan antara fase diam dan fasa gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam
dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa
geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase
gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul. Fase Diam dan Fase Gerak Fase diam yang digunakan
dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin
kecil ukuran rata-rata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka
semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Silika gel salah satu contoh fase diam
yang terbentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam
struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan silika gel, atom silikon berlekatan pada gugus
-OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Permukaan silika gel sangat
polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang
sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol. Fase diam
lainnya yang biasa digunakan adalah alumina dari aluminium oksida. Atom aluminium pada
permukaan juga memiliki gugus -OH. Pada dasarnya sifat serta penggunaannya mirip silika gel.

Fasa Diam Mekanisme sorpsi Penggunaan

Silika gel Adsorpsi Asam amino,

hidrokarbon, vitamin,
alkaloid

Salah satu Adsorben yang sering digunakan :

 Silika gel

Yang paling banyak digunakan dalam pengujian, bersifat asam lemah, sering ditambah
CaSO4 (gibs) sebagai pengikat agar melekat kuat pada penyangga. Penambahan ini juga
mempercepat mengeringnya lapis tipis. Juga dapat ditambahkan indicator fluoresensi yang akan
berfluoresensi di bawah sinar UV pada 254 nm, hingga noda yang mengabsorpsi pada frekuensi
ini menjadi sangat kontras terhadap latar belakang yang berfluoresensi hijau kuning. Silica gel
sangat higroskopis, pada humaditas relative 45 – 75% akan menarik air sampai 7 – 20%. Derajat
diaktivasinya ditentukan oleh kelembaban ruangan dimana pemisahan akan dilakukan atau
tempat penyimpanan lapis tipisnya. Kemurnian juga penting karena dapat mempengaruhi watak
kromatografi beberapa senyawa tertentu. Pencemar dalam adsorben ini dapat juga
menyebabkan dekomposisi senyawa yang hendak dianalisa.

 Prosedur Kerja dengan Kromatografi Lapis Tipis

1. Pada KLT, fasa diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil
digambar dekat bagian bawah fasa diam dan setetes larutan sampel ditempatkan di atasnya.
Sampel ditotol dengan bantuan pipa kapiler. Garis pada fasa diam berguna untuk menunjukkan
posisi asli sampel. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan
dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika
titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri 7 dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa
gerak dengan posisi fasa gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan
bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.
2. Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik. Komponen-komponen yang berbeda dari
campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang
berbeda.
3. Diagram menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak sekitar setengah jalan. Pelarut
diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan
 pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut
dan fase diam.
4. Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan
pereaksi kimia dan reaksi-reaksi warna. Untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun
harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas.
5. Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga
standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh berlaku untuk campuran
tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk
berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.

 Nilai Rf Kromatografi Lapis Tipis

Senyawa -senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik dikerjakan dengan pereaksi
kimia dan reaksi -reaksi warna. Pada umumnya untuk identifikasi senyawa menggunakan harga
Rf. Harga Rf didefinisikan sebagai berikut :
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut

 Faktor –faktor yang mempengaruhi KLT

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga
mempengaruhi harga Rf adalah :
1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak
5. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
6. Teknik percobaan
7. Jumlah cuplikan yang digunakan
8. Suhu
9. Kesetimbangan.

 Beberapa kelebihan KLT yaitu:

1. KLT lebih banyak digunakan untuk tujuan analisis.
2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi,
atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.
3. Dapat dilakukan elusi secara mekanik (ascending), menurun (descending), atau dengan
cara elusi 2 dimensi.
4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan
merupakan bercak yang tidak bergerak.
5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.
6. Biaya yang dibutuhkan terjangkau.
7. Jumlah perlengkapan sedikit.
8. Preparasi sample yang mudah
9. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan
metode kertas tidak bisa
 Adapun kekurangan KLT yaitu:
1. Butuh ketekunan dan kesabaran yang ekstra untuk mendapatkan bercak/noda yang
diharapkan.
2. Butuh sistem trial and eror untuk menentukan sistem eluen yang cocok.
3. Memerlukan waktu yang cukup lama jika dilakukan secara tidak tekun

 KLT DENSITOMETER
- Metoda analisis instrumental berdasarkan interaksi radiasi elektro magnetik dengan
analit yang merupakan noda pada KLT
- Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai pancaran sinar dengan
panjang gelombang diatur dari 200 - 700 nm.
- Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)
Kromatografi lapis tipis densitometri dapat dilakukan untuk analisis kuantitatif dan kualitatif.

 Teknik penggunaannya :
- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan (hanya untuk TLC dengan pendukung gelas),
- Sinar yang diserap dan dipantulkan
- Atau sinar yang dipendarkan.
Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada
densitometer digunakan alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti
photomultiplier pada spektrofotometer. Pada era perkembangan, saat ini pemakaian "Thin
Layer Chromatograph Scanner" yang lebih populer dengan nama densitometer makin
banyak dipakai.

 Penggunaan KLT Densitometri

- Analisis kuantitatif : analit-analit dengan kadar sangat kecil yang merupakan hasil pemisahan
dengan KLT.
- S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif
ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti testosteron dalam cairan biologis pada rentang
kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2- 150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan
pengukuran pendaran pada noda (kromatogram) KLT.
 Kelebihan KLT Densitometri
- Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda pada KLT akan lebih terjamin
kesahihannya dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi) atau KGC
(Kromatografi Gas Cair) sebab area noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zig-
zag" menyeluruh.
- Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang dirajah terhadap area tidak
menunjukkan garis lurus, akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati parabola