com
www.ijcrt.org © 2023 IJCRT | Volume 11, Edisi 3 Maret 2023 | ISSN: 2320-2882
Abstrak :Upaya ini telah dilakukan untuk meninjau prinsip-prinsip dasar dan pentingnya kromatografi lapis tipis
(KLT) dalam metode analisis yang berbeda, penelitian secara umum dan fitokimia. KLT dapat dilakukan dengan teknik
yang tidak terlalu rumit, waktu yang minimum, biaya rendah, sederhana sehingga mudah dioperasikan. Ini memiliki
penerapan yang luas di laboratorium kimia umum selama beberapa dekade untuk memisahkan produk kimia dan
biomolekul secara rutin. Juga memiliki aplikasi luas dalam analisis farmasi dan dalam mengidentifikasi pengotor
dalam suatu senyawa. KLT dapat digunakan sebagai metode analisis awal sebelum HPLC. Hal ini juga berguna untuk
memantau kemajuan suatu reaksi dan identifikasi senyawa yang ada dalam suatu zat tertentu. Studi menyoroti
tinjauan TLC dan penerapannya di berbagai bidang seperti toksikologi lingkungan, makanan, dan analisis herbal.
Kata kunci: Kromatografi Lapis Tipis, Prinsip Nilai TLC Rf, Keunggulan KLT, Penerapan KLT.
Perkenalan-
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah prosedur analisis kimia yang digunakan untuk
pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Teknik kromatografi ini ditemukan pada tahun 1906 oleh M.
Tswett. Teknik ini melibatkan
menempatkan larutan sampel pada pelat KLT, fase diam adalah padatan atau cairan yang didukung pada padatan.
Pelat KLT dilapisi dengan lapisan tipis bahan penyerap, seperti silika gel, aluminium oksida, atau selulosa.
Lapisan tipis adsorben ini dikenal sebagai fase diam.
Setelah sampel terlihat di dekat bagian bawah pelat ini, masukkan pelat tersebut ke dalam bejana yang berisi
fase gerak. Gaya kapiler menarik fase gerak melalui pelat, yang mendorong pemisahan campuran sampel
dalam kromatografi.
Setelah mengeringkan pelat KLT, kita dapat mengamati masing-masing pita melalui serapan atau fluoresensi.
Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa yang ada dalam suatu zat, misalnya
memantau kemajuan reaksi. Pemisahan ini didasarkan pada partisi diferensial antara fase gerak dan
fase diam. Ada berbagai jenis teknik kromatografi seperti kromatografi kolom, kromatografi kertas
dll. Diantaranya Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah teknik laboratorium yang banyak digunakan.
Teknik ini mirip dengan kromatografi kertas. Dalam kromatografi kertas kami menggunakan kertas
sebagai fase diam.
Namun, pada kromatografi lapis tipis melibatkan fase diam dari lapisan tipis adsorben dibandingkan dengan kromatografi
kertas, artinya lebih cepat, memberikan pemisahan yang lebih baik.
Prinsip TLC:KLT biasanya dilakukan pada pelat kaca atau plastik kecil yang dilapisi dengan lapisan tipis bahan
padat. Yang paling umum adalah silika (SiO2) atau alumina (Al2O3). Ini adalah fase diam. Fase gerak
merupakan pelarut organik atau campuran pelarut. Campuran sampel dioleskan di dekat bagian bawah pelat
sebagai titik kecil, kemudian ditempatkan dalam toples berisi beberapa ml pelarut. Pelarut naik ke atas pelat
melalui aksi kapiler, membawa campuran sampel bersamanya. Setiap senyawa dalam campuran bergerak
dengan kecepatan berbeda, bergantung pada kelarutannya dalam fase gerak dan kekuatan penyerapannya
terhadap fase diam. Ketika pelarut mencapai bagian atas pelat, ia dibiarkan menguap, meninggalkan
komponen-komponen campuran pada berbagai jarak dari titik asal. Perbandingan jarak perpindahan suatu
senyawa dengan jarak perpindahan pelarut adalah nilai Rf ( faktor retensi) . Nilai ini merupakan karakteristik
senyawa, pelarut dan fase diam.
Nilai RF:
Perilaku suatu senyawa dalam KLT dicirikan oleh besaran yang dikenal sebagai RFdan d dinyatakan
sebagai pecahan desimal. Istilah RFdikaitkan dengan migrasi zat terlarut relatif terhadap bagian depan
pelarut sebagai:
Misalnya, jika komponen merah menempuh jarak 1,7 cm dari garis basa sedangkan pelarut menempuh jarak 5,0 cm,
maka RFnilai untuk komponen merah adalah
RF=1.7
5.0
= 0,34
IJCRT2303633 Jurnal Internasional Pemikiran Penelitian Kreatif (IJCRT)www.ijcrt.org f511
www.ijcrt.org © 2023 IJCRT | Volume 11, Edisi 3 Maret 2023 | ISSN: 2320-2882
Jika kita dapat mengulangi percobaan ini pada kondisi yang sama persis, maka nilai Rf untuk setiap
komponen akan selalu sama. Misalnya saja RFnilai pewarna merah akan selalu 0,34. Namun, jika ada
perubahan (suhu, komposisi pasti pelarut, dan sebagainya), hal tersebut tidak berlaku lagi.
Rf suatu senyawa adalah konstan dari satu percobaan ke percobaan berikutnya hanya jika kondisi kromatografi di
bawah ini juga konstan.
1. Sistem pelarut: Kemurnian pelarut dan jumlah pelarut yang dicampur harus dikontrol dengan ketat. Ini harus
dibuat segar setiap kali dijalankan jika salah satu pelarut sangat mudah menguap atau higroskopis. Contoh aseton.
2. Adsorben: Adsorben yang berbeda akan memberikan R yang berbeda pulaFnilai untuk pelarut yang sama. Reproduksibilitas adalah
hanya mungkin untuk adsorben tertentu dengan ukuran partikel dan pengikat yang konstan. Pelat harus disimpan di atas
silika gel dalam desikator sebelum digunakan dan sampel harus diaplikasikan dengan cepat sehingga uap air di atmosfer
tidak diserap oleh pelat. Karena kesulitan yang terkait dengan prosedur aktivasi, jauh lebih baik menggunakan pelat yang
disimpan pada suhu kamar dan untuk mengaktifkannya.
3. Ketebalan adsorben: Pelat standar kira-kira 250 mikrometer adalah ketebalan lapisan yang lebih disukai. Di bawah 200, R
Fnilainya sangat bervariasi. Lapisan tersebut mungkin memiliki ketebalan yang lebih tinggi atau lebih rendah pada masing-
masing senyawa.
4. Jumlah material yang terlihat: Menambah massa sampel pada pelat sering kali akan meningkatkan RFobat,
terutama jika obat tersebut biasanya berada dalam sistem. Namun, jika pelat kelebihan muatan, hal ini juga
akan menimbulkan tailing spot dan akan berdampak pada penurunan R.Fnilai. Kedua situasi ini biasanya
mudah dibedakan berdasarkan intensitas titiknya.
Pelat (Fase diam):Pelat yang juga dikenal sebagai pelat kromato dapat dibuat di laboratorium, namun paling
sering dibeli. Silika gel dan alumina merupakan fase diam yang paling umum digunakan, namun fase diam
lainnya juga tersedia. Banyak pelat mengandung senyawa yang berfluoresensi di bawah gelombang pendek
UV (254nm). Bagian belakang pelat TLC sering kali terbuat dari kaca, aluminium, atau plastik. Pelat kaca bersifat
inert secara kimia dan paling tahan terhadap noda reaktif dan panas, namun rapuh dan sulit dipotong. Pelat
aluminium dan plastik dapat dipotong dengan gunting. Ketebalan lapisan adsorben biasanya sekitar 0,1-0,25
mm untuk tujuan analitis dan sekitar 0,5-2,0 mm untuk KLT preparatif.
Bercak piring:Ujung tipis spotter ditempatkan dalam larutan encer; larutan akan naik di kapiler (kekuatan kapiler).
Sentuh sebentar pelat di garis start. Biarkan pelarut menguap dan letakkan kembali di tempat yang sama. Dengan
cara ini Anda akan mendapatkan tempat yang terkonsentrasi dan kecil. Usahakan untuk menghindari bercak
material terlalu banyak, karena hal ini akan sangat menurunkan kualitas pemisahan ( t̀ailing'). Titik-titik tersebut
harus cukup jauh dari tepinya dan juga dari satu sama lain. Jika memungkinkan, Anda harus melihat senyawa atau
campuran bersama dengan bahan awal dan kemungkinan zat antara pada pelat.
Lokasi tempat:Posisi berbagai zat terlarut yang dipisahkan dengan KLT dapat ditentukan dengan berbagai metode. Zat
berwarna dapat dilihat secara langsung bila dilihat terhadap fasa diam, sedangkan zat tak berwarna hanya dapat dideteksi
dengan membuatnya terlihat dengan menggunakan suatu bahan penyemprot, yang menghasilkan area berwarna di
wilayah yang ditempatinya.
Khususnya di TLC berikut ini dapat digunakan untuk menyemprot tempat yang terlihat:
1. Karena sifatnya anorganik murni, bahan korosif juga dapat digunakan untuk menyemprot pada tempat yang tidak
terlihat.
2. Encerkan larutan kalium dikromat dalam asam sulfat pekat. Dalam prosesnya, kalium
dikromat (kuning) direduksi menjadi kromat sulfat (hijau) oleh sebagian besar senyawa organik, terutama yang digunakan
untuk gula.
3. Uap belerang trioksida, yang dihasilkan dari pemanasan asam sulfat yang berasap, menghanguskan senyawa organik dan
menjadikannya terlihat sebagai bintik hitam.
4. Larutan kalium permanganat.
5. Uap yodium.
Reagen umum lainnya termasuk larutan jenuh hidrogen sulfida, berair 0,2N
amonium sulfida, 0,1% kuersetin beralkohol, 0,2% metanol oksin, dan 0,5% natrium rhodizonat berair. Jika
adsorben yang digunakan untuk pelat KLT mengandung bahan berfluoresensi, zat terlarut dapat dilihat di
bawah sinar ultraviolet.
Fase Seluler: Untuk kromatografi silika gel, fase geraknya adalah pelarut organik atau campuran pelarut organik.
Saat fase gerak bergerak melewati permukaan gel silika, ia mengangkut analit melewati partikel fase diam. Namun
molekul analit hanya bebas bergerak bersama pelarut jika tidak terikat pada permukaan silika gel. Dengan demikian,
fraksi waktu dimana analit terikat pada permukaan gel silika relatif terhadap waktu yang dihabiskannya dalam
larutan menentukan faktor retensi analit. Kemampuan analit untuk mengikat permukaan gel silika dengan adanya
pelarut atau campuran pelarut tertentu dapat dipandang sebagai penjumlahan dari dua interaksi kompetitif.
Pertama, gugus polar dalam pelarut dapat bersaing dengan analit untuk mendapatkan tempat pengikatan pada
permukaan gel silika. Oleh karena itu, jika digunakan pelarut yang sangat polar, pelarut tersebut akan berinteraksi
kuat dengan permukaan gel silika dan akan meninggalkan beberapa tempat pada fase diam yang bebas untuk
berikatan dengan analit. Oleh karena itu, analit akan bergerak cepat melewati fase diam. Demikian pula, gugus polar
dalam pelarut dapat berinteraksi kuat dengan fungsi polar dalam analit dan mencegah interaksi analit dengan
permukaan gel silika.
Efek ini juga menyebabkan pergerakan cepat analit melewati fase diam. Polaritas pelarut yang akan
digunakan untuk kromatografi dapat dievaluasi dengan memeriksa konstanta dielektrik (simbol )dan momen dipol (
simbol )dari pelarut. Semakin besar kedua bilangan tersebut, semakin polar pelarutnya. Selain itu, kemampuan
ikatan hidrogen pelarut juga harus diperhatikan. Misalnya metanol merupakan donor ikatan hidrogen yang kuat dan
akan sangat menghambat kemampuan semua analit kecuali yang paling polar untuk mengikat permukaan gel silika.
Mengembangkan Piring:KLT dapat dibuat dalam gelas kimia atau toples tertutup. Tempatkan sedikit pelarut (fasa
gerak) dalam wadah. Setitik kecil larutan yang berisi sampel dioleskan pada piring, sekitar satu sentimeter dari
alasnya. Pelat tersebut kemudian dicelupkan ke dalam pelarut yang sesuai, seperti heksana atau etil asetat, dan
ditempatkan dalam wadah tertutup. Pelarut bergerak ke atas pelat melalui aksi kapiler dan bertemu dengan
campuran sampel, yang terlarut dan dibawa ke atas pelat oleh pelarut.
Senyawa yang berbeda dalam campuran sampel bergerak dengan kecepatan yang berbeda karena perbedaannya
ketertarikan terhadap fase diam, dan karena perbedaan kelarutannya dalam pelarut. Dengan mengganti
pelarut, atau mungkin menggunakan campuran, pemisahan komponen (diukur dengan RFnilai) dapat
disesuaikan. Tingkat pelarut harus berada di bawah garis KLT, jika tidak noda akan hilang. Tepi bawah pelat
kemudian dicelupkan ke dalam pelarut. Pelarut (eluen) bergerak ke atas matriks melalui kapilaritas,
menggerakkan komponen sampel dengan laju yang bervariasi karena tingkat interaksinya yang berbeda
dengan matriks (fase diam) dan kelarutannya dalam pelarut yang berkembang. Pelarut non-polar akan
memaksa senyawa nonpolar berada di urutan teratas, karena senyawa tersebut larut dengan baik dan tidak
berinteraksi dengan fase diam polar. Biarkan pelarut naik ke atas pelat hingga ~1 cm dari atas. Keluarkan pelat
dan segera tandai bagian depan pelarut. Jangan biarkan pelarut mengalir melewati tepi piring. Selanjutnya
biarkan pelarutnya menguap seluruhnya.
1. Sampel harus dilarutkan dalam pelarut nonpolar karena pelarut polar cenderung menyebarkan titik
awalnya.
2. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel harus mudah menguap.
3. Saat mengaplikasikan sampel, permukaan adsorben tidak boleh diganggu karena hal ini akan merusak bentuk
bintik pada kromatogram yang dikembangkan selanjutnya, sehingga menghambat keakuratan pengukuran
kuantitatif.
4. Titik sampel harus berdiameter 2-5 mm.
Visualisasi:Ketika bagian depan pelarut telah berpindah sekitar 1 cm dari ujung atas adsorben (setelah 15
hingga 45 menit), pelat harus dikeluarkan dari ruang pengembangan, posisi bagian depan pelarut ditandai,
dan pelarut dibiarkan menguap. . Jika komponen sampel diberi warna maka dapat diamati secara langsung.
Jika tidak, mereka kadang-kadang dapat divisualisasikan dengan menyinari sinar ultraviolet pada pelat atau
dengan mendiamkan pelat selama beberapa menit dalam wadah tertutup yang atmosfernya jenuh dengan uap
yodium. Kadang-kadang noda dapat divisualisasikan dengan menyemprotkan reagen pada pelat yang akan
bereaksi dengan satu atau lebih komponen sampel.
Misalkan Anda memiliki campuran asam amino dan ingin mengetahui jenis asam amino apa yang terkandung dalam campuran
tersebut. Untuk mempermudah, kami berasumsi bahwa Anda mengetahui bahwa campuran tersebut hanya mungkin
mengandung lima asam amino yang umum. Setetes kecil campuran ditempatkan pada garis dasar pelat lapisan tipis, dan titik-titik
kecil serupa dari asam amino yang diketahui ditempatkan di sampingnya. Pelat kemudian didiamkan dalam pelarut yang sesuai
dan dibiarkan berkembang seperti sebelumnya. Pada diagram, campurannya adalah M, dan asam amino yang diketahui diberi
label 1 sampai 5. Diagram sebelah kiri menunjukkan pelat setelah bagian depan pelarut hampir mencapai atas. Bintik-bintik itu
masih tidak terlihat. Diagram kedua menunjukkan tampilan setelah disemprot dengan ninhidrin.
Tidak perlu mengukur RFnilai karena Anda dapat dengan mudah membandingkan titik-titik dalam campuran dengan
titik-titik asam amino yang diketahui- baik dari posisi maupun warnanya.
Dalam contoh ini, campuran tersebut mengandung asam amino yang diberi label 1,4 dan 5. Dan bagaimana jika campuran tersebut
mengandung asam amino selain yang telah kita gunakan sebagai perbandingan?
Aplikasi
Kromatografi lapis tipis telah menjadi alat yang berguna dalam berbagai aplikasi kepentingan farmasi.
Asam amino
TLC asam amino lebih sulit dibandingkan TLC tinta, karena asam amino tidak berwarna. Oleh karena itu, seseorang
tidak dapat melihat bintik-bintik tersebut dengan mata telanjang jika piring telah berkembang sempurna dan kering.
Untuk melihat bintik-bintik tersebut, perlu menggunakan teknik visualisasi ninhidrin atau cahaya hitam. Misalnya,
Asam amino, protein dan peptida 8: Campuran 34 asam amino, protein dan peptida telah berhasil dipisahkan dan
diisolasi dari urin menggunakan pelat silika gel. Semua zat ini ditemukan positif ninhidrin. Pengembangan dilakukan
terlebih dahulu dengan kloform-metanol-20% amonium hidroksida (2:2:1) dan kemudian dengan fenol-air.
KLT digunakan dalam identifikasi, pengujian kemurnian dan penentuan konsentrasi bahan aktif, zat
pembantu dan pengawet dalam obat dan sediaan obat, pengendalian proses pada proses manufaktur
sintetik. Berbagai farmakope telah menerima teknik TLC untuk mendeteksi pengotor suatu obat atau
bahan kimia. Misalnya, Antibiotik: Penisilin telah dipisahkan pada silika gel G̀' dengan menggunakan dua
pelarut, aseton-metanol (1:1) dan iso-propanol-metanol (3:7). Sebagai zat pendeteksi, reaksi iodin-azida
digunakan dengan menyemprotkan pelat kering dengan larutan iodin 0,1% yang mengandung 3,5%
natrium azida.
Ini digunakan dalam analisis kualitatif alkaloid dalam fase kontrol formulasi farmasi dan obat nabati. KLT telah
digunakan untuk isolasi dan penentuan alkaloid dalam toksikologi dimana waktu pengoperasian 30-60 menit
memberikan keuntungan besar dibandingkan dengan waktu 12-24 jam yang diperlukan untuk kromatografi kertas.
Alkaloid purin telah dipisahkan dengan KLT pada asam silikat, silika gel dan aluminium oksida. Bintik-bintik tersebut
divisualisasikan dengan penyemprotan terlebih dahulu dengan larutan alkohol yodium kalium yodium diikuti dengan
25% HCl-96% etanol (1:1).
Untuk penentuan zat aktif dan metabolitnya dalam matriks biologis, diagnosis gangguan metabolisme seperti
fenilketonuria, sistinuria dan penyakit sirup maple pada bayi. Ini berfungsi sebagai alat yang berguna dalam
analisis konstituen urin yang berasal dari lipid dalam analisis banyak konstituen urin seperti asteroid, asam
amino, porfirin dan asam empedu. Analisis urin dengan KLT paling efektif bila dilakukan bersamaan dengan
proses kromatografi lainnya, sehingga metabolit kecil dapat dideteksi dan diselesaikan sepenuhnya bebas dari
komponen lain.
Tata rias
Dalam identifikasi bahan baku pewarna dan produk akhir, pengawet, surfaktan, asam lemak dan
penyusun parfum.
Analisis Makanan
Untuk penentuan pestisida dan fungisida dalam air minum, residu, salad dan daging, vitamin dalam minuman ringan,
bahan tambahan yang dilarang di Jerman (misalnya ekstrak cendana dalam ikan dan produk daging), kepatuhan terhadap
nilai batas (misalnya senyawa polisiklik dalam air minum, aflatoksin dalam susu dan produk susu).
Kromatografi Lapis Tipis (TLC), yang biasa digunakan dalam analisis campuran kompleks, jarang digunakan
dalam penyelidikan produk minyak bumi, mungkin merupakan objek yang paling kompleks. Khususnya,
sehubungan dengan produk minyak bumi berat, tidak ada informasi seperti itu yang ditemukan dalam
literatur. Pada saat yang sama, kesederhanaan, ekonomi, dan efisiensi teknik ini dibandingkan dengan
kromatografi kolom merupakan keunggulan yang diketahui secara luas. Teknik TLC digunakan (dalam varian
preparatif) untuk penentuan cepat komposisi kelompok produk minyak bumi (aspal, pitches, tinggal), dan
sehubungan dengan studi spektroskopi komposisi kimia dari fraksi yang diperoleh.
Sistem yang dimediasi surfaktan kationik dan non-ionik telah digunakan sebagai fase gerak dalam
pemisahan kromatografi lapis tipis amina aromatik pada lapisan silika gel. Pengaruh konsentrasi
surfaktan di bawah dan di atas konsentrasi misel kritis terhadap mobilitas amina diperiksa. Pengaruh
bahan tambahan organik dan anorganik seperti alkohol, urea, NaCl dan NaBr dalam larutan misel
terhadap mobilitas dan efisiensi pemisahan amina juga dinilai.
a) Telah banyak digunakan untuk memeriksa sejumlah proses pemisahan lainnya. TLC juga telah berhasil
diterapkan dalam berbagai proses pemurnian, pemeriksaan fraksi distilasi dan untuk memeriksa
kemajuan pemurnian dengan distilasi molekuler.
b) KLT telah digunakan sebagai alat analisis dalam kimia organik karena kecepatan pemisahannya yang tinggi dan
penerapannya pada sejumlah besar senyawa kimia. Kegunaannya yang penting adalah dalam pemisahan dan isolasi
masing-masing komponen campuran, namun dalam kimia organik telah digunakan untuk: memeriksa kemurnian
sampel, sebagai proses pemurnian, untuk identifikasi senyawa organik, untuk mempelajari berbagai reaksi organik,
dalam mengkarakterisasi dan mengisolasi sejumlah senyawa seperti asam, alkohol, glikol, Amida, alkaloid, vitamin,
asam amino, antibiotik, bahan makanan dan pemeriksaan reaksi. Campuran reaksi diperiksa dengan KLT untuk
menilai apakah reaksi telah selesai atau belum. Metode ini juga digunakan dalam memeriksa proses pemisahan dan
proses pemurnian lainnya seperti distilasi, distilasi molekuler, dll.
1. Singhal S., Singhal N., Agarwal S., Analisis Farmasi II, Kromatografi lapis tipis, Pragati
prakashan, Edisi pertama, 2009, 98-111.
2. Kasture AV, Mahadik K.R, Wadodkar SG, More HN, Buku Ajar Analisis Farmasi, Metode
Instrumental, Nirali Prakashan, 9thedisi 2005, jilid II, 18-30.
3. Quach HT, Steeper RL, Griffin GW, Pemisahan pigmen tumbuhan dengan kromatografi lapis
tipis. Jurnal pendidikan kimia. 2004, 81, 385-7.
4. Skoog DA, Holler FJ, dan Nieman TA, 'Prinsip analisis instrumental', penerbitan perguruan tinggi
Saunders, 5thedisi 2006.761-766.
5. Chatwal GR, Anand SK, Metode instrumental analisis kimia, penerbit Himalaya, 5thedisi 2008,
2.599-2.616.
6. Beckett A. h., Stenlake jb, Kimia Farmasi Praktis, Kromatografi Lapis Tipis, Penerbit CBS, 4th
edisi 2005, 115-128.
7. Ali M. dan Agrawal V., Kromatografi lapis tipis amina aromatik, Ilmu dan Teknologi Pemisahan,
2002, 37, 363-377.
8. Sharma bk, Metode instrumental analisis kimia, penerbit Goal, Meerut, 5th
edisi 2007, 241-264.
9. Vidya sagar, Metode instrumental analisis obat, Pharma Med Press, Edisi pertama 2009,263.
10. Justus G. Kirchner, Analisis kuantitatif kromatografi lapis tipis, Jurnal kromatografi A, 1
Agustus 1973, Volume 82, Edisi1, 101-115.