TUGAS KELOMPOK FITOKIMIA

“Pengantar Kromatografi Planar dan Penerapannya pada

Isolasi Produk Alami”

Di Susun Oleh :

Kelompok 6

AS’AD (PO713251171060)

ASA ANNISA (PO713251171059)

FITRI RAMADANI (PO713251171066)

NURFEBIYANTI YUSUF (PO713251171082)

RAHMI (PO713251171085)

REZKY SEPTIAH R. (PO713251171086)

RUSNIA (PO713251171089)
 BAB 6
Pengantar Kromatografi Planar dan Penerapannya pada
Isolasi Produk Alami

Abstrak

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah metode yang mudah, murah, cepat, dan paling
banyak digunakan untuk analisis dan isolasi produk alami dan sintetis organik. Metode Ini juga
telah digunakan dalam evaluasi biologis senyawa organik, terutama di bidang metabolit
antimikroba dan antioksidan dan untuk evaluasi inhibitor asetilkolinesterase yang memiliki
kegunaan dalam pengobatan penyakit Alzheimer. Kemudahan dan murahnya penggunaan teknik
ini, ditambah dengan kemampuan yang dengan cepat mengembangkan pemisahan dan protokol
bioassay akan memastikan bahwa TLC akan digunakan untuk beberapa waktu bersama dengan
metode instrumental konvensional. Bab ini membahas prinsip-prinsip dasar TLC dan
menjelaskan metode untuk analisis dan isolasi produk alami. Contoh metode untuk isolasi
beberapa kelas produk alami dirinci dan diberikan protokol untuk bioassay TLC .

Kata kunci: Kromatografi lapis tipis, KLT, HPTLC, Bioassays, isolasi produk alami

1. Pendahuluan

Kromatografi planar memanfaatkan pemisahan campuran senyawa organik pada lapisan

tipis adsorben yang dilapisi dengan kaca, plastik, atau lembaran aluminium.l Kromatografi
planar yang digunakan adalah kromatografi lapis tipis (TLC) yang merupakan teknik termudah
dan termurah untuk isolasi produk alami. TLC adalah salah satu bentuk kromatografi tertua,
contoh paling sederhana adalah eksperimen spot ting ekstrak tanaman di dekat bagian bawah
potongan tipis kertas blotting dan "dikembangkan" dalam toples dengan air atau alkohol. Saat air
bergerak sampai kertas blotting, ekstrak gelap dipisahkan menjadi warna-warna komponen dari
cahaya dan hijau gelap. Ini adalah inti dari pemisahan oleh TLC karena lapisan tipis dalam
metode ini adalah kertas blotting aktif dimana pemisahan itu terjadi.

Bab ini menjelaskan prinsip-prinsip di balik teknik sederhana ini dan memberikan
prosedur untuk menganalisis ekstrak dan mengisolasi alami produk sehingga siapa pun dapat
menggunakan TLC untuk mengisolasi dan menganalisis produk organik dan senyawa sintetis
dari sumber apa pun. Contohnya isolasi TLC dari metabolit tanaman diberikan secara terperinci.
Keberhasilan dalam TLC bergantung pada fleksibilitas pendekatan dan bereksperimen dengan
berbagai metode. Tidak ada metode pemisahan yang sempurna untuk suatu campuran tetapi
pengalaman logis dan berurutan akan menghasilkan protokol yang disesuaikan dan berguna. ini
Penting untuk mencoba beberapa metode sebelum metode yang ideal ditemukan, dan bagi
mereka yang memulai penelitian mereka, bersabarlah makan akan memberikan hasil luar biasa!
Ekstrak produk alami dalam banyak kasus sangat kompleks dan terdiri dari campuran
netral, asam, basa, lipofilik, hidrofilik, dan senyawa amfifilik (mis., asam amino) dan akibatnya
tidak akan ada satu metode yang dapat digunakan untuk semua kemungkinan. Penting untuk
melakukan 1 Spektroskopi H atau 13C NMR dari ekstrak atau fraksi untuk menentukan kelas
senyawa yang dipisahkan (1) —Pelarut NMR yang diuterisasi murah ($ 1,00 untuk CDCl 3 )
dan percobaan 1D NMR lebih cepat dijalankan daripada pengembangan luas fase bergerak dan
stasioner yang mungkin dibutuhkan. Pertama ,Titik awal harus selalu menjadi metode paling
sederhana dan contoh untuk isolasi sejumlah kelas yang berbeda produk alami diberikan dalam
Subpos 3 yang diambil dari literatur dan penelitian penulis sendiri.

Kemudahan penggunaan, kecepatan dan biaya TLC yang rendah membuatnya menjadi
banyak digunakan dan teknik serba bisa yang mudah dipelajari. Sementara HPLC dan varian
ultra-tekanan (UPLC) sangat populer sebagai metode pilihan untuk “pembersihan” terakhir untuk
mendapatkan produk alami yang telah dimurnikan, inspeksi makalah dari jurnal Surat
Phytochemistry, Analisis Phytochemical, Phytotherapy Penelitian, Planta Medica,
Phytochemistry, dan Journal of Natural Produk di tahun 2010 masih menunjukkan bahwa TLC
memiliki tempat utama dalam isolasi dan analisis produk alami. TLC juga mudah berinteraksi
dengan bioassay dan kemungkinan bahwa banyak tes penghambatan enzim baru yang
menggunakan perubahan kolorimetri pada piring TLC akan dikembangkan sebagai tes pertama
yang sederhana untuk aktivitas biologis. Penulis mendorong siapa pun yang melakukan
penelitian pertama mereka dengan produk alami untuk bereksperimen dengan sejumlah besar
penyerap dan pelarut. Metode TLC ini dianjurkan karena sedikit saja perubahan dalam suatu
metode secara dramatis dapat mempengaruhi pemisahan.

1.1. Prinsip dasar

dari TLC

Pemisahan dengan TLC dipengaruhi oleh aplikasi campuran atau ekstrak sebagai tempat
atau garis tipis ke sorben yang telah diterapkan ke pelat. Pelat TLC analitik (ketebalan 0,1-0,2
mm) tersedia secara komersial dari pemasok, seperti Merck (mis., pelat gel silika analitik yang
paling umum berukuran 20 × 20 cm, plastik atau plat Kieselgel 60 F 254 yang didukung
aluminium yang memiliki ketebalan sorben silika 0,2 mm ; Merck No. 5554). Piring kemudian
ditempatkan ke dalam tangki pengembangan gelas dengan pelarut yang sesuai dan cukup untuk
membasahi tepi bawah piring / sorben tetapi tidak cukup untuk membasahi bagian piring di mana
bintik bintik itu diterapkan. Pelarut awal kemudian bermigrasi ke atas piring melalui sorben
karena aksi kapiler dan proses ini dikenal sebagai pengembangan (Gbr. 1).

Faktor dalam mengkuantifikasi pergerakan (migrasi) senyawa pada sistem sorben dan
pelarut tertentu adalah nilai Rf.

Rf = jarak yang ditempuh substansi

jarak yang ditempuh pelarut

Contoh :

Rf = 2,3 cm/2, 8 cm

= 0,82

Nilai Rf Ini didefinisikan sebagai: nilai rasio, tidak pernah lebih besar dari satu, dan
bervariasi tergantung pada sorben dan / atau sistem pelarut. Nilai-nilai ini terkadang dikutip
sebagai h Rf, mis., relatif terhadap pelarut depan = 100, h Rf = Rf × 100 (dalam kasus kami h Rf
= 82). Dalam hal adsorpsi kromatografi (lihat di bawah), di mana sorben adalah silika, kutub
senyawa (mis., artemisinin; Gbr. 2) akan memiliki afinitas yang lebih tinggi untuk sorben (fase
diam), dan akan "menempel" pada sorben dan bergerak perlahan ke atas piring saat pelarut (fase
gerak) bermigrasi. Senyawa ini akan memiliki Rf yang relatif kecil nilai-nilai. Nonpolar
senyawa (mis., psilocybin; Gbr. 2) akan memiliki kurang afinitas untuk fase diam, akan bergerak
relatif cepat ke atas piring, dan akan memiliki Rf yang relatif lebih besar nilai-nilai. Sebagai
konsekuensi dari pengembangan, senyawa campuran akan terpisah sesuai dengan mereka
polaritas relatif. Polaritas terkait dengan jenis dan jumlah gugus fungsi hadir pada molekul yang
mampu mengikat hidrogen.
 Artemisinin adalah senyawa yang relatif nonpolar jika dibandingkan dengan psilocybin
(Gbr. 2), tetapi harus dicatat bahwa ini relatif polaritas akan bervariasi sesuai dengan jenis fase
diam dan fase seluler digunakan. Kekuatan pelarut juga diukur dari segi polaritas dan konstanta
dielektrik yang umum digunakan untuk mengukur kekuatan relatif mereka (Tabel 1). Konstanta
dielektrik yang tinggi menunjukkan pelarut polar dengan daya elusi yang kuat dan yang rendah
konstanta dielektrik menunjukkan pelarut nonpolar dengan kemampuan lebih rendah untuk
mengelusi komponen dari sorben. Kekuatan elusi ini berlaku untuk kromatografi adsorpsi fase
normal.

1.2. Mekanisme Pemisahan

Ada empat mekanisme kromatografi yang digunakan pemisahan dapat terjadi dan lebih
dari satu mekanisme mungkin bertanggung jawab selama pemisahan yang diberikan.

(a) Kromatografi Adsorpsi. Sorben yang paling umum digunakan yang digunakan dalam bentuk
kromatografi adalah silika dan alumina. Saat komponen bergerak melalui sorben, mereka
tingkat migrasi relatif dipengaruhi oleh afiliasi masing-masing untuk sorbent. Pemisahan
terjadi ketika satu senyawa lebih kuat teradsorpsi oleh sorben daripada komponen lainnya.
Ketika sorben adalah silika atau alumina, kutub alami produk bergerak lambat jika
dibandingkan dengan nonpolar natural produk. Adsorpsi terjadi karena interaksi antara
senyawa dan kelompok yang terkait dengan sorben. Dalam kasus silika yang memiliki
kelompok silanol (Gambar 3), terjadi pengikatan antara senyawa dan hidroksil bebas pada
 sorben. Di dalam kasus khusus ini, adsorpsi melibatkan ikatan hidrogen antara gugus fungsi
majemuk dan permukaan adsorben gugus hidroksil.

(b) Kromatografi partisi. Mekanisme ini melibatkan perbedaan antara kelarutan relatif senyawa
antara sorben (fase diam) dan pelarut (fase gerak). Senyawa yang lebih larut dalam fase
gerak akan bermigrasi naik ke tingkat yang lebih besar daripada komponen yang lebih larut
dalam fase diam. TLC fase terbalik menggunakan sorben yang membagi produk alami
antara fase bergerak dan stasioner. Ini biasanya berlemak (lipid) fase diam dan fase gerak
pelarut berair / organik. Sorben fase terbalik yang paling umum digunakan adalah silika
telah direaksikan dengan unit alkil karbon 18 rantai lurus ke membentuk fase octadecasilyl
(ODS) dan banyak fase lipofaring alternatif tersedia secara komersial (Gbr. 4). Nonpolar
Senyawa "berlemak", seperti artemisinin seskuiterpen (Gbr. 2), siap "larut" dalam fase diam
seperti ODS dan selama pengembangan pelarut partisi diatur antara dua fase. Pemisahan
dipengaruhi oleh senyawa yang dimilikinya tingkat partisi yang berbeda antara fase
stasioner dan fase gerak.

(c) Kromatografi inklusi / eksklusi ukuran. Senyawa mungkin dipisahkan oleh ukuran relatif
mereka dan oleh pemasukan mereka (atau pengecualian) ke dalam sorben. Inklusi ukuran
yang paling umum digunakan sorben adalah gel dekstran, khususnya versi lipofilik, seperti
Sephadex LH-20, yang paling banyak digunakan untuk pemisahan produk alami hidrofobik
kecil dari mereka "kontaminan" yang lebih besar biasanya klorofil, karoten, lemak asam, dan
gliserida. Dalam pelarut organik, seperti kloroform dan metanol, gel ini membesar untuk
membentuk matriks. Sebagai senyawa bermigrasi dengan pelarut melalui gel, molekul kecil
menjadi dimasukkan (terjebak) ke dalam matriks gel dan mol mol yang lebih besar
dikeluarkan dan bermigrasi pada tingkat yang lebih cepat. Harus mencatat bahwa pemisahan
pada
gel,
seperti
 Sephadex LH-20, juga melibatkan, sebagian, mekanisme adsorpsi, partisi, dan mungkin
pertukaran ion dan kadang-kadang tren molekul yang lebih besar eluting pertama dan molekul
kecil eluting terakhir mungkin terbalik karena mekanisme ini. Bentuk kromtografi ini telah
banyak digunakan dalam menghilangkan pigmen tanaman yang "mengganggu", seperti
klorofil yang cenderung menjadi lebih besar dan lebih lipofilik daripada banyak produk alami
tanaman. Pigmen besar ini dielusi dengan cepat melalui gel dan mudah dihilangkan dari
metabolit yang lebih kecil.

(d) Kromatografi penukar ion. Teknik ini terbatas pada campuran yang mengandung komponen
yang memiliki kemampuan untuk dibawa muatan elektronik. Dalam bentuk kromatografi ini,
sorben biasanya merupakan resin polimer yang mengandung polar grup dan ion penghitung
seluler yang dapat bertukar dengan ion komponen saat fase seluler bermigrasi melalui sorben
Pemisahan dicapai oleh perbedaan afinitas antara komponen ionik dalam campuran dan
stasioner tahap. Dalam pertukaran kation, gugus asam, seperti –CO 2 H dan–JADI 3 H,
dimasukkan ke dalam resin dan dapat ditukar protonnya dengan kation komponen lain dalam
campuran formulir –CO 2 - , H 3O + dan –JADI 3- , H 3O + , masing-masing, pada
khususnya rentang pH. Dalam pertukaran anion, kelompok dasar seperti kuaterner amonium
moieties (−N+ R 3 ) dimasukkan ke dalam resin dan dapat menukar anionnya dengan anion
komponen yang ada dalam campuran (juga lihat Bab 8)

1.3 Aplikasi dari TLC

Secara tradisional, analisis TLC telah diaplikasikan dalam deteksi dan pemantauan
senyawa melalui proses pemisahan atau dalam sintesis suatu senyawa. Dalam kasus produk
alami yang diketahui, atau senyawa lain, mis., Obat-obatan, kualitatif, dan informasi kuantitatif
dapat dikumpulkan mengenai keberadaan atau tidak adanya metabolit. Contohnya adalah
produksi antitumor diterpene Taxol (Gbr. 5) dari jamur endofit Taxomyces andreanae.(3) taxol
jamur terisolasi itu punya nilai-nilai Rf yang identik dengan taksol dari pasifik, Taxus brevifolia
pada empat sistem pelarut yang berbeda (Gbr. 5).

Penggunaan empat sistem pelarut memberi tingkat keakuratan yang lebih tinggi dari
taxol jamur menjadi otentik, meskipun penulis melakukan percobaan ini dengan spektrometri
massa. TLC analitik telah digunakan untuk mengklasifikasikan organisme oleh konstituen
kimianya, khususnya bakteri fi lamentous, Actinomycetes. Yang penting genus Streptomyces
umumnya mengandung stereoisomer LL sel metabolit dinding dikenal sebagai asam
diaminopimelic, sedangkan yang lebihumum memiliki bentuk meso dari metabolit ini. Dengan
menghidrolisis dinding sel bakteri dan menjalankan TLC hidrolisis terhadap dua standaryang
secara bebas mengklasifikasikan actinomycetes (4).

Produk alami juga dapat diidentifikasi dengan menjalankan analitik TLC setelah proses
pemisahan lainnya, seperti kromatografi kolom atau HPLC, dan selalu lebih dari satu sistem
pelarut harus digunakan untuk pemisahan TLC, karena bahkan bintik-bintik yang “murni”
mungkin terlihat terdiri dari beberapa senyawa dengan nilai-nilai Rf identik

Kesamaan ekstrak berbeda dari spesies yang sama dapat juga dinilai dengan cara ini dan
keputusan untuk menggabungkan nonpolar dan ekstrak kutub dapat dibuat pada kromatografi
TLC yang identik atau serupa. Skrining awal kualitatif ekstrak oleh TLC harus dilakukan secara
rutin dan keberadaan senyawa di mana-mana, seperti sterol dan fenolat tanaman tertentu, dapat
dipastikan pada suatu tahap awal dengan menjalankan standar yang sesuai dengan ekstrak.
Dalam kasus tertentu, kelas senyawa dapat ditentukan dengan menyemprot pelat yang telah
dikembangkan dengan noda yang memberikan reaksi warna dengan kelas senyawa tertentu (lihat
Subpos 3.3.2).

Banyak produk alami masih diisolasi oleh TLC pra-paratif konvensional (PTLC) dan
banyak contoh masih dapat ditemukan di jurnal Phytochemistry, Jurnal Produk Alam, Planta
Medica, Analisis Phytochemical, dan Phytochemistry Letters. Meskipun preparatif HPLC dan
UPLC saat ini sedang dalam "mode" dan secara rutin digunakan di banyak laboratorium, PTLC
masih merupakan metode isolasi yang sangat berguna dalam banyak kasus karena
kesederhanaan, biaya, kecepatan, dan kemampuan untuk memisahkan senyawa dalam 1 mg − 1
kisaran g.

2. Bahan

Pelat TLC analitik pracetak tersedia dengan berbagai sorbet, termasuk silika, alumina,
C18, selulosa, dan lainnya, di mana biasanya ketebalannya 0,2 mm. Pelat PTLC yang sudah
dipreparasi dengan berbagai bahan juga mencakup berbagai pelat analitik yang diproduksi oleh
Merck, mis., Alumina; Tebal 0,2 mm; 20 × 20 cm; dengan indikator UV 254 nm (Merck No.
5550). Pelat PTLC yang tersedia secara komersial biasanya terbatas pada silika sorben, alumina,
C18, dan selulosa dan biasanya memiliki ketebalan 0,5, 1,0, dan 2,0 mm. Piring gel silika yang
didukung kaca 60 dari Merck memiliki distribusi ukuran partikel 5–40 mm bila dibandingkan
dengan pelat analitik yang sesuai 5–20 mm.

Untuk menyiapkan lima pelat preparatif Silika secara manual, item-item berikut
diperlukan: lima pelat backing kaca 20 × 20 cm, aplikator gerbang yang dapat disesuaikan, dua
pelat spacer kaca 5 × 20 cm, Kieselgel 60 (45 g) Merck 7749, penahan plat, perak nitrat (1 g)
(opsional), pelapis pelat TLC, air suling (90 mL), dan labu berbentuk kerucut 200 mL dengan
sumbat (lihat Subpos 3.4.4 untuk prosedur).

Tangki TLC (terbuat dari kaca) dengan ukuran yang sesuai (tangki lebih kecil untuk TLC
analitik, dan lebih besar untuk PTLC) diperlukan. Lampu UV banyak tersedia secara komersial
dari pemasok, seperti CAMAG (Camag Ref. 022.9230). Reagen semprot (Tabel 2) dan
mengembangkan pelarut atau fase gerak (Tabel 3) diperlukan. Pemanas genggam (pengering
rambut!) Untuk mengeringkan pelat TLC, dan oven untuk memanaskan pelat TLC setelah
disemprot dengan beberapa pereaksi, mis., Vanillin-sulfuric acid.

Untuk CPTLC, pelat dan motor ditempatkan dalam peralatan di mana atmosfer nitrogen
dapat diterapkan. Contoh yang sangat baik dari peralatan CPTLC adalah Chromatotron (Harrison
Research Model 7924), yang memiliki saluran untuk mengumpulkan eluting band dan jendela
kuarsa yang sesuai dengan pelat sehingga memungkinkan visualisasi pelat dengan cahaya UV.

Alat dan peralatan khusus yang diperlukan untuk bentuk khusus kromatografi planar,
mis., HPTLC, telah disebutkan dalam metode individual dalam Subpos 3.
Tabel 2
Sepuluh jenis semprot sederhana untuk visualisasi TLC produk alami

Deteksi Cara Pengerjaan Catatan

semprotan
Vanilin/asam Larutkan vanilin (4 g) Semprotkan ke piring Semprotan universal.
sulfur dalam H2SO4 pekat dan panaskan pada Banyak terpen yang
(100 mL) 100°C sampai muncul memberikan warna
warna merah dan biru. Produk
alami dengan sedikit
fungsionalitas dapat
memberikan warna yang
buruk-coba semprotan
PMA. Semprotkan dan
panaskan di lemari uap.
Asam Larutkan dalam etanol Semprotkan ke piring Berguna untuk
fosfomolibdat untuk membuat 5% dan panaskan pada mendeteksi banyak
(PMA) w/v larutan 100°C sampai muncul terpen berbintik-bintik
warna biru. Semprotkan dan
panaskan di lemari uap.
Amonium Larutkan Amonium Semprotkan ke piring
molibdat (VI) molibdat (VI) (10 g) dan panaskan pada Semprotan universal.
dalam H2SO4 pekat 100°C sampai muncul Banyak Terpen yang
(100 mL) warna memberi warna biru
semprot dan panaskan di
lemari asap.
Antimon (III) Larutkan Antimon Semprotkan ke piring Di- dan triterpen
klorida (III) klorida dalam dan panaska pada suhu memberikan warna
campuran glasial asam 100°C sampai muncul merah menjadi biru.
asetat (20mL) dan warna Perhatian, harus diambil
kloroform (60 mL) ketika menangani
semprotan ini sebagai
antimon karena senyawa
ini sangat beracun.
 Semprotkan dan
panaskan di lemari uap.
Timah (IV) Tambahkan Timah Semprotkan ke piring Berguna untuk mendetesi
klorida (IV) klorida (10mL)ke dan panaskan selama 5 flavonoid dan terpen.
dalam campuran menit dengan suhu Timah (IV) klorida
kloroform (80 ml) 100°C atau sampai beracun dan lachrymator.
terjadi perubahan warna Semprotkan
danpanaskan di lemari
uap
Reagen Tambahkan 10 ml Secara umum, tidak Ini adalah metode
Dragendorff larutan KI cair 40% diperlukan panas-tetapi tradisional untuk deteksi
menjadi 10 ml dari jika reaksi tidak terjadi, alkaloid meskipun
larutan 0,85 g substrat maka dipanaskan sampai perawatan harus
bismut dasar di asam terjadi perubahan warna. dilakukan karena
asetat (10 ml) dan air beberapa non alkaloid,
aquadest (50 ml). seperti iridoid, dan
Encerkan larutan yang beberapa flavonoid,
dihasilkan dengan berikan positif reaksi.
asam asetat dan air Alkaloid memberikan
dalam perbandingan warna orange gelap
1:2:10 hingga merah.
2,4-Dinitro- Larutkan 2,4-Dinitro- Umumnya, tidak Mendeteksi aldehida dan
phenyl- phenyl-hydrazine (0,2 diperlukan panas tetapi keton dengan warna
hydrazine g) dalam 2 N HCl (50 jika reaksi tida terjadi, kuning sampai merah
ml) panaskan sampai terjadi
perubahan warna.
Asam perklorat A 20 % (b/v )larutan Panaskan pada suhu Semprotan universal
asam perklorat 100°C sampai terjadi tetapi berguna untuk
perubahan warna steroid dan triterpen
Borntrager A 10% (b/v) larutan Panaskan hingga terjadi Untuk mendeteksi
reagen etanol KOH perubahan warna kumarin dan antrakuinon
Ninhydrin Tambahkan ninhydrin Panaskan pada 100°C Terutama berguna untuk
(0,3 g) ke dalam sampai terjadi perubahan asam amino,amina, dan
campuran butanol 100 warna sebagai semprotan
(ml) dan asam asetat alkaloid umum. Alkaloid
(3 ml) muncul sebagai warna
merah.

Tabel 3

SistemSimpel untuk TLC

SistemPelarut Sorben Catatan

heksana: etilasetat (EtOAc) Silika gel Sistem universal — dapat menggantikan

heksana dengan light potrelium spirit

Bensin: dietileter (Et 2 O)
Bensin: kloroform (CHCl3)
Toluena: EtOAc: asamasetat
(TEA)
CHCl 3: aseton
Benzena: aseton
Butanol: asamasetat: air
Butanol: air: piridin: toluena
Metanol (MeOH): air
asetonitril: air
MeOH: air
atau pentana.
Silika gel Suatu sistem universal untuk metabolit
yang relatif nonpolar. Sangat baik untuk
terpena dan asam lemak. Perawatan
harus diambil dengan Et2O
karenacampuran eksplosif terbentuk di
udara.
Silika gel Sangat berguna untuk pemisahan sinamat
turunan asam, khususnya kumarin.
Silika gel Berbeda komposisi, yaitu, 80: 18: 2 atau
60: 38: 2 — sangat baik untuk metabolit
asam.
Silika gel Sistem umum untuk produk polaritas
sedang.
Silika gel Sistem umum untuk produk polaritas
sedang Benzena: asetonSilika gel
Berguna untuk pemisahan produk
aromatik.Perawatan harus diambil karena
benzene adalah sangat pelarut yang
karsinogenik. Pengganti toluene untuk
benzena
Silika gel Sistem kutub untuk flavonoid dan
glikosida
Silika gel Sistem analisis Gula. Coba 10: 6: 6: 1.
Pengembangan mungkin membutuhkan 4
jam
C18 Mulailah dengan 100% MeOH untuk
menentukan apakah metabolit akan
pindahdariasal. Tingkatkan Air
konsentrasi untuk “memperlambat”
produk. Penambahan Jumlah kecil dari
asam atau basa dapat meningkatkan
kromatografi
C18/C2 Sebuah system fase-balik sederhana yang
universal
Poliamida Universal
MeOH: air Selulosa Digunakan untuk pemisahan senyawa
yang sangat polar, seperti gula dan
glikosida

3. Metode

3.1. Pemilihan Sistem

Informasi sebanyak mungkin mengenai organism penghasil ekstrak harus dikumpulkan

karena ini akan membantu dalam pemilihan system pemisahan. Setelah pencarian literature
lengkap tentang organism telah dilakukan, poin-poin berikut perlu ditangani.

(a) Apakahspesiestelahdipelajarisebelumnya?

(b) Jikaya, metabolitapa yang diisolasi?

(c) Apakahadametode TLC standar yang tersedia?

(d) jika spesies belum dipelajari untuk kimia, apakah ada informasi di tingkat generik?

Kemotaksonomi atau klasifikasi suatu organisme sesuai dengan produk alami dapat
membantu dalam (5), dan sangat mungkin bahwa spesies yang terkait satu sama lain
menghasilkan metabolit sekunder terkait. Basis data, seperti Abstrak Kimia, NAPRALERT,
Berdy, Kamus Produk Alami, dan dalam kasus tanaman, teks klasik tertentu., Seperti berurusan
dengan genera yang tidak diketahui dapat Hegnauers 'DieChemotaxonomicderPflanzen (6), dapat
memberikan hasil yang hebat banyak informasi mengenai kelas produk alami yang ada dalam
taksa tertentu. Informasi tentang sampel semipurifikasi (cg, fraksi kolom) juga dapat sangat
berharga. Beberapa pekerja (1,7) secara rutin merekam spektra 'H NMR fraksi kolom sebelum
pemurnian TLC Ini mungkin tampak sistem pendeteksian yang agak mahal, tetapi banyak
informasi dapat dikumpulkan tentang kelas senyawa yang hadir dengan teknik ini dan TLC
Metode dapat "disesuaikan" sesuai. TLC pada gel silika masih merupakan metode kromatografi
planar yang paling umum meskipun menderita beberapa kelemahan yang mungkin mudah
diatasi.

(a) Senyawa asam pada silika karena interaksi antara gugus asam (mis., -CO, H, -OH) dan
silanol. Ini dapat dikurangi dengan penambahan sejumlah kecil asam (mis., Asam
trifluroasetat 1% atau asam acetic) ke fase gerak dan ini akan mempertahankan setiap
gugus asam dalam bentuk nonionisasi. dapat "mengekor" dan "melesat" dengan aliran
nonband
 (b) Senyawa dasar juga dapat berperilaku buruk pada basa lemah (misalnya, 1% dietilamin
harus pada silika dan penambahan atau trietilamina) meningkatkan juga menghilangkan
tailing dan kromatografi
(c) Senyawa yang sangat nonpolar, seperti alkana, dan beberapa terpenaid yang lebih rendah
(lebih kecil) seperti mono dan seskuiterpen membutuhkan sistem pelarut nonpolar
sederhana (misalnya, cyclohexane, hexanc, pentane, diet campuran campuran heksana
heksana) dan mungkin sulit dideteksi oleh sinar UV ( seperti yang mereka miliki,
kromofor) atau dengan deteksi semprotan (gunakan pereaksi arang, mis. asam vanillin-
sulfuric
(d) Metabolit yang sangat polar, seperti gula, glikosida, tanin, polifenol, dan alkaloid tertentu
membutuhkan pengembangan fase gerak polar dan dalam beberapa kasus diserap secara
ireversibel ke dalam silika. Pilihan fase gerak harus berkembang melalui penggunaan
sistem mono atau biner, yaitu, 100% CHCI, atau heksana: EtOAc (1: 1) ini tidak
memberikan hasil yang baik maka penambahan asam atau basa untuk meningkatkan
kromatografi, ic , toluena: Asam EtOAcacetic (60: 38: 2) harus dicoba dan sebagai upaya
terakhir penggunaan sistem tersier atau kuaterner, mis., butanol: asam asetat: air (4: 1: 5)
atau heksana: EtOAc: asam format: air (4: 4: 1: 1) harus dipekerjakan.

3.2. Pilihan Pembangunan

Keputusan apakah sistem dijalankan secara isokratis (menggunakan satu sistem pelarut
dengan komposisi konstan) atau menggunakan step gradient ent (berkembang sekali dalam
pelarut nonpolar dan kemudian secara sistematis meningkatkan polaritas pelarut setelah setiap
pengembangan) dapat dibuat dengan menjalankan serangkaian pelat analitik dengan sampel di
berbagai kekuatan fase seluler. Kedua sistem memiliki kelebihan dan kemampuan masing-
masing dapat digunakan dengan beberapa pengembangan di mana plat dikembangkan dioperasi,
dikeringkan, dan dikembangkan beberapa kali. Ini khususnya berguna dalam pemisahan senyawa
yang terelusi secara ketat. Tabel 3 daftar beberapa sistem yang lebih umum digunakan.

3.3. Deteksi Produk Alami dalam TLC

Pada tahap TLC analitik dan preparatif, visualisasi atau deteksi yang efektif sangat
penting untuk mendapatkan senyawa murni dan deteksi yang buruk juga akan menghasilkan
pemulihan produk yang rendah dari sorbent. Deteksi biasanya tidak rusak, di mana senyawa
dapat diperoleh kembali dari sorben [Ultraviolet (UV) deteksi) atau destruktif, di mana senyawa
terkontaminasi oleh reagen deteksi dan tidak dapat dipulihkan dari sorben (Deteksi semprotan).
Ada beberapa teks bagus yang tersedia tentang ini subjek, seperti Analisis Obat Tanaman Wagner
dan Bladt (8) atau Buku Pegangan Merck Reagen Pencelupan untuk Lapisan Tipis dan Kertas
Kromatografi (9), dan ini mencakup sebagian besar kemungkinan.
3.3.1. Deteksi Ultraviolet

Deteksi UV melibatkan penggunaan senyawa aktif UV (indikator)yang dimasukkan ke

sorben piring TLC oleh produsen Contoh-contoh pelat dengan sorben ini termasuk berbagai pelat
analitik yang diproduksi oleh Merck: Alumina; Tebal 0,2 mm; 20 × 20 cm; dengan indikator UV
254 nm (Merck No. 5550). Di bawah sinar UV gelombang pendek (254 nm), indicator yang
biasanya seng silikat mangan-diaktifkan, akan memancarkan pucat lampu hijau. Di bawah sinar
UV gelombang panjang (366 nm), indikator lebih lanjut akan memancarkan cahaya ungu pucat.
Senyawa yang menyerap cahaya pada 254 atau 366 nm akan muncul sebagai bintik-bintik gelap
dengan latar belakang cahaya ketika sinar UV bersinar ke piring. Banyak senyawa, seperti
furocoumarin, juga akan memancarkan cahaya biru atau kuning di bawah sinar UV. Kerugian
utama dengan deteksi UV adalah bahwa senyawa yang tidak menyerap sinar UV pada 254 atau
366 nm tidak akan terlihat dan akan membutuhkan deteksi semprotan. Keuntungan utama deteksi
UV adalah, tidak rusak dan deteksi senyawa dapat diamati dengan mudah melalui proses
pemisahan. Lampu UV banyak tersedia secara komersial dari pemasok, seperti CAMAG (Camag
ref. 022.9230). Perawatan harus diambil untuk tidak menyinari cahaya dari lampu ini ke mata
atau pada kulit karena sinar UV bersifat mutagenik.

3.3.2. Deteksi Semprot

Ini bergantung pada reaksi warna antara senyawa pada pelat TLC dan pereaksi semprot
(pewarnaan) yang dimasukkan ke piring sebagai kabut kabut dari tabung semprot. Sepuluh
reagen semprot yang paling umum digunakan tercantum dalam Tabel 2 . Sebagian besar adalah
reagen universal dan akan bereaksi dengan banyak kelas produk alami dan semprotan yang
paling banyak digunakan adalah asam vanillin-sulfuric, asam phosphomolybdic, dan semprotan
ammonium molybdate (VI) (Tabel 2 ). Reagen Dragendorff sangat berguna untuk mendeteksi
banyak kelas alkaloid dan sangat layak untuk dilakukan. Dalam beberapa kasus, panas
diperlukan untuk membantu reaksi warna dan ini dapat diberikan dalam bentuk pemanas
genggam (pengering rambut!) Atau oven pengeringan. Semua senyawa yang diperlukan untuk
membuat reagen semprot sudah tersedia dari pemasok, seperti Sigma-Aldrich. Setiap reagen
semprot harus dibuat segar dan digunakan dalam lemari asap.

Saat menggunakan deteksi semprotan dalam TLC preparatif (lihat Subpos 3.4 ), sebagian
besar pelat harus ditutup (dengan kertas tisu) dan hanya sebagian kecil dari tepi (2 cm) yang
disemprotkan dengan reagen. Idealnya, pisau bedah harus digunakan untuk mencetak garis 2 cm
dari tepi pelat sehingga setelah penyemprotan, semprotan reagen korosif tidak bermigrasi ke
sorbent dan merusak senyawa.

3.4. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

PTLC telah lama menjadi metode isolasi yang populer terutama karena aksesibilitasnya
yang universal kepada mahasiswa dan peneliti yang bekerja dalam kimia produk alami.
Popularitas ini telah berkurang dalam beberapa tahun terakhir karena keberhasilan kromatografi
cair tekanan tinggi dan kromatografi arus berlawanan. Tidak seperti kedua teknik ini, PTLC tidak
membutuhkan peralatan yang mahal, pemisahan dapat dilakukan dengan cepat dan jumlah bahan
yang diisolasi umumnya jatuh ke dalam kisaran 1 mg hingga 1 g yang tentunya cukup untuk
tujuan penjelasan struktur. Bagian ini memberikan uraian langkah-langkah dasar PLC dengan
penekanan pada persiapan dan pelat berjalan dan beberapa keuntungan dan kerugian yang
dihadapi dengan PTLC.

3.4.1. Kapan Menggunakan PTLC

Meskipun pemisahan tergantung pada tingkat kerumitan ekstrak, PTLC hampir selalu
digunakan sebagai langkah pemurnian akhir dalam prosedur isolasi. Prosedur luas diberikan di
bawah ini.
Biomassa Ekstrak Ekstrak Non-Polar Kromatografi Kolom
Partisi PTLC
(Tanaman, Mikroba laut, VLC, Flash, HPLC Lebih
Ekstrak Polar
Serangga) dari satu step?

Jumlah senyawa yang dapat dipisahkan pada pelat prep pada akhirnya akan tergantung
pada bagaimana senyawa tersebut berperilaku pada sistem tertentu tetapi sebagai aturan
pemisahan tidak lebih dari campuran tiga komponen utama harus dicoba. Pemisahan campuran
kompleks dapat dilakukan pada PLC sebagai tahap pertama tetapi jumlah bahan yang lebih besar
diperlukan dan karena proses menjalankan banyak piring dapat memakan waktu, itu lebih biasa
untuk memisahkan campuran yang dimurnikan sebagian. Ekstrak kompleks harus, dalam contoh
pertama, dipisahkan melalui cairan vakum

HO OH
MeO 2C

Gbr. 6. Struktur friedelane triterpene.

Kromatografi (VLC), kromatografi abu, atau kromatografi kolom konvensional sebelum

PTLC. Untuk memberikan contoh bagaimana berbagai proses pemisahan ini telah digunakan,
triterpen friedelane (Gbr. 6 ) diisolasi dari kulit pohon hutan hujan Cameroonian Phyllo Tryon
spathulatum (10) menggunakan proses pemisahan berikut.

1. Ekstrak kulit tanah P. spathulatum dengan bensin dan CHCl3 .

 2. Tunduk ekstrak ke VLC pada Silica gel eluting dengan heksana - campuran EtOAc.
3. Lakukan TLC (fase gerak: toluen: EtOAc: AcOH = 80: 18: 2) pada fraksi yang dielusi
dengan 25% EtOAc dalam heksan untuk mengisolasi triterpenoid friedelane (Gbr. 6 ).

Triterpen ini hanya membutuhkan satu langkah pemurnian sebelum PTLC dan
karenakurangnya kromofor yang khas, senyawa ini membutuhkan visualisasi dengan deteksi
semprotan (pereaksi vanilin, Tabel 2 ).

3.4.2. Peningkatan Skala dari Analitik ke PTLC

Prosedur peningkatan dari analitik (ketebalan sorbent 0,1-0,2 mm) menjadi preparat KLT
(ketebalan sorben 0,5-4 mm) sangat penting, karena mengubah skala (ukuran) pemisahan dapat
secara drastis mempengaruhi kromatografi produk alami. Kromatografi senyawa yang
dipisahkan pada pelat analitik, dimana mikrogram hingga level miligram rendah dari bahan yang
terlibat dapat berubah secara signifikan ketika 10 miligram dipisahkan. Pada normal phase silica,
ketika bergerak dari skala analitik ke prep, diperlukan untuk mengurangi polaritas pelarut secara
nyata. Sangat sering ini adalah prosedur coba-coba, tetapi sebagai contoh pemisahan campuran
dua komponen dicapai dengan menggunakan heksan: EtOAc (60:40) sebagai fase gerak pada
pelat analitik mungkin memerlukan sistem hexane yang kurang polar: EtOAc (90:10) pada pelat
persiapan untuk memberikan sebanding Rf yang nilai. Ini adalah aturan umum dan akan
bervariasi sesuai dengan kelas senyawa yang dipisahkan dan jenis fase diam yang digunakan —
metode terbaik adalah mengorbankan sebagian kecil campuran dan bereksperimen.

3.4.3. Piring PTLC yang tersedia secara komersial

Pelat ini biasanya terbatas pada adsorben silika, alumina, C 18 , dan selulosa dan
biasanya memiliki ketebalan 0,5, 1,0, dan 2,0 mm. Kaca yang didukung silika gel 60 piring dari
Merck memiliki distribusi ukuran partikel dari 5-40 m m bila dibandingkan dengan analitis yang
sesuai pelet dari 5-20 m m. Plat silika ini memiliki luas permukaan spesifik tinggi bersifat
homogen dan dapat memberikan hasil pemisahan yang sangat baik.

Penggunaan pelat prep yang tersedia secara komersial dengan zona konsentrasi juga
meningkatkan pemisahan. Zona ini adalah lapisan silika pori besar inert di bagian bawah pelat ke
mana sampel diterapkan. Ketika pelarut bermigrasi melalui zona ini, campuran tidak ditahan dan
berfokus pada antarmuka antara zona dan sorben "normal". Aplikasi campuran yang tidak merata
difokuskan sebagai garis diskrit dan ini sangat meningkatkan pemisahan.

Plat fase normal, seperti plat 2 mm Merck Kieselgel 60 F254 20 × 20 cm (Merck No.
5717), memerlukan pra-elusi dengan pelarut nonpolar, seperti diklorometana untuk
"membersihkan" dan menghilangkan kontaminan. Kotoran ini akan dibawa dengan pelarut ke
atas piring dan kemudian piring harus dikeringkan sebelum digunakan. Ketika kotak baru
dibuka, pelat yang tidak digunakan yang harus disimpan dalam desikator karena kelembaban dari
udara akan mempengaruhi "aktivitas" sorbent (terutama dalam kasus silika dan alumina) yang
menghasilkan resolusi berkurang dan pemisahan lebih buruk.

3.4.4. Preparatif Plat Buatan Sendiri

Membuat pelat milikmu sendiri memungkinkan fleksibilitas yang lebih besar dari pilihan
Plat Persiapan sorbent, sedangkan plat komersial dibatasi pada 3 atau 4 sorbent, dengan resep
yang tepat plat buatan rumahan menawarkan cakupan eksperimen yang jauh lebih luas. Pelat ini
juga memungkinkan variasi ketebalan untuk mengakomodasi pemisahan sejumlah besar
material. Pengikat, seperti kalsium sulfat (gypsum), diperlukan untuk mengikat sorban di piring
tetapi beberapa adsorben silika. mis., Merck 7749 mengandung binder yang cukup untuk tujuan
tersebut. Mempersiapkan piring Anda sendiri juga akan memberi Anda pilihan untuk memilih
sorben dengan atau tanpa indikator UV dan juga memungkinkan penggabungan aditif ke dalam
sorbent yang meningkatkan pemisahan. Contoh dari ini (resep yang ditunjukkan di bawah)
adalah penambahan sejumlah kecil perak nitrat ke sorben silika yang akan membantu dalam
penyelesaian senyawa olefinik.

Jika biaya menjadi masalah, maka membuat pelat juga lebih murah daripada alternatif
komersial dan menghilangkan sorben dari dukungan pelat selama proses desorpsi lebih mudah
daripada pada pelat komersial — suatu hal yang perlu dipertimbangkan jika senyawa tidak
terselesaikan dengan baik. Contoh berikut adalah metode untuk membuat plat preparasi silika
dengan ketebalan 0,5 mm dengan aditif perak nitrat opsional. Untuk pelat dengan ketebalan 1
atau 2 mm, diperlukan 2 atau 4 kali jumlah air dan sorben dan semua peralatan sudah tersedia
dari pemasok, seperti CAMAG atau Merck. Peralatan dan bahan yang dibutuhkan untuk
menyiapkan pelat PTLC dibahas dalam Subpos 2 . Prosedur persiapan PTLC (ketebalan 0,5 mm)
dapat diringkas sebagai berikut:

1. Bersihkan plat penahan kaca dengan 1 N KOH berair dan kemudian aseton dan akhirnya
kering sebelum disebarkan.
2. Tempatkan pelat ke dalam pelat pelat TLC dengan pelat spacer di kedua ujungnya.
3. Sesuaikan aplikator dengan ukuran pelat yang benar dan letakkan di salah satu ujung plat
spacer.
4. Masukkan silika (45 g) atau sorben alternatif dan perak nitrat (jika perlu) ke dalam kerucut,
tanyakan (250 mL) dan tambahkan air (90 mL).
5. Kocok flush kerucut yang ditanyakan dengan keras selama 30 detik untuk memastikan bahwa
bubur yang homogen dihasilkan

6. Segera tuangkan bubur ke dalam aplikator dan dengan satu gerakan mantap tarik
aplikatormelintasi permukaan pelat untuk beristirahat di spacer plat jauh.
7. Biarkan piring kering denganudara selama 1 jam dan kemudian dimasukkan ke dalam
wadah piring dan aktifkan dalam oven pada suhu 115 ° C selama 4 jam sebelum
 digunakan.
Metode umum ini dapat diterapkan untuk sorbent lain meskipun pengikat tambahan
mungkin diperlukan. Ketika memasukkan perak nitrat ke dalam sorben, pelat harus disimpan dan
dikembangkan dalam gelap untuk menghindari perubahan warna dan degenerasi sorbent.

3.4.5. Contoh Aplikasi

Prep plate seperti yang disebutkan di atas harus dikeluarkan dari oven dan dibiarkan
dingin sampai suhu kamar sebelum digunakan. Sampel yang akan dipisahkan harus dilarutkan
dalam volume minimum pelarut sebanyak mungkin (biasanya dalam kisaran konsentrasi 10-20
mg / mL). Sampel ini kemudian diterapkan ke bagian bawah piring (1,5 cm dari bawah) sebagai
garis tipis (2-4 mm tebal) menggunakan kapiler, atau pipet Pasteur yang telah diekstrusi ke
aplikator tipis dengan memanaskannya. pembakar Bunsen. Kapiler yang lebih tipis (5-10 mL)
memberikan kontrol yang lebih besar terhadap aplikasi sampel dan menghasilkan serat, garis
yang lebih terkonsentrasi dan karenanya hasil yang lebih baik. Untuk menentukan sampel
dengan cara yang lurus dan seragam, lebih disukai untuk menggambar garis pensil dengan ringan
(tanpa mencetak sorbent!) Sekitar 1,5 cm di atas tepi pelat atau sebagai alternatif menggunakan
selembar kertas A4 ditempatkan pada piring sebagai panduan. Penerapan sampel sebagai garis
lurus diperlukan karena ini membentuk asal dan dengan asumsi bahwa pelaut itu homogen,
selama pengembangan, sampel akan terpisah menjadi senyawa dengan pita genap. Jika sampel
diterapkan secara tidak teratur (yaitu, garis bergelombang), maka selama pengembangan sampel
akan terpisah menjadi senyawa dengan pita tidak teratur yang sulit untuk dihilangkan dalam
bentuk murni dari piring selama proses desorpsi.

Sampel juga tidak boleh diaplikasikan sampai ke kedua tepi piring sebagai efek tepi
(pergerakan cepat pelarut ke sisi pelat atau homogenitas sorbent yang buruk) akan menghasilkan
pergerakan pelarut yang tidak rata ke atas piring selama pengembangan dan sebagai
konsekuensinya bentuk band tidak teratur.

3.4.6. Pengembangan dan Deteksi

Sistem pelarut yang sesuai dan fase sorbent harus dipilih dari eksperimen dengan pelat
analitik dan beberapa kasus yang lebih sederhana diberikan dalam Subpos 3.1 dan dalam contoh
(Subpos 3.10 ). Fase gerak untuk sistem prep harus dibuat baru dan biasanya 100 mL volume
cocok untuk menjalankan satu atau dua pelat dalam tangki yang sama. Atmosfer jenuh pelarut
dalam tangki lebih disukai untuk meningkatkan kromatografi dan ini dapat diproduksi dengan
menambahkan beberapa kertas filter bersih (berukuran 15 × 15 cm) di tangki yang sedang
berkembang.

Silica gel adalah sorbent yang cukup "reaktif" dan beberapa produk alami tidak stabil
pada fase ini. Harus juga diperhatikan bahwa selama pengembangan, pelat harus dijauhkan dari
sinar matahari langsung karena degradasi cahaya juga dapat terjadi pada beberapa produk alami.
 Perkembangan ini dicapai dengan memungkinkan bagian depan pelarut mencapai bagian
atas pelat atau berada dalam jarak beberapa milimeter dan kemudian mengeluarkan pelet dari
tangki dan mengeringkan udara dalam lemari uap. Pengering genggam harus dihindari untuk
menghilangkan pelarut berlebih dari pelat karena risiko degradasi berbantuan panas.

Sebagian besar sampel semipurifikasi memiliki warna residu atau produk alami yang
menarik dapat diwarnai sehingga mungkin untuk mengukur seberapa jauh senyawa telah
bermigrasi ke atas piring. Dalam kasus ekstrak tanaman, pigmen nonpolar, seperti klorofil (hijau)
atau karoten (oranye menjadi merah) dapat memberikan bantuan visual untuk pemisahan dan
gagasan tentang sejauh mana senyawa-senyawa yang menarik telah bermigrasi relatif terhadap
pigmen. Jika produk alami yang menarik menyerap sinar UV panjang atau pendek, maka
keberhasilan pemisahan dapat dengan mudah diamati di bawah sinar UV — ini sangat berguna
dalam berbagai perkembangan dan bermanfaat untuk melihat senyawa terselesaikan melalui
proses isolasi! Dengan produk penyerap UV yang buruk, penggunaan pereaksi semprot
diperlukan (lihat Subpos 3.3.2 ) dan penyemprotan hanya pada ujung pelat akan memberikan
gambaran seberapa jauh produk alami yang diminati telah bermigrasi. Jika setelah deteksi
semprotan, senyawa tersebut belum bermigrasi cukup jauh ke atas piring untuk menimbulkan
pemisahan, maka silika yang disemprotkan yang terkontaminasi (atau sorben lainnya) harus
dibuang untuk menghindari kontaminasi sebelum pengembangan kembali.

3.4.7. Desorpsi dan Pemulihan Produk Alami

Setelah keputusan dibuat bahwa pemisahan senyawa telah dicapai dengan memuaskan,
produk alami perlu dipulihkan secara efektif dari sorbent, dikeringkan dan disimpan untuk
penjelasan struktur. Pada contoh silika yang diberikan di atas, dimana indikator fluoresensi UV
dimasukkan ke dalam sorbent, pita penyerap UV (senyawa) dapat ditandai dengan pensil atau
pisau bedah dan digosokkan pelat penahan ke atas kertas timah atau kertas. Dengan deteksi
semprotan, pita dapat dipotong dari tepi berwarna semprotan (tetapi tidak memasukkannya!) Di
sepanjang pelat menggunakan penggaris. Pita-pita ini dapat dihilangkan dari pelat ke kertas
timah. Senyawa dapat diserap dari sorbent dengan tiga cara sederhana.

(a) Sorbent kaya senyawa dapat dimasukkan ke dalam larutan berbentuk kerucut dan
pelarut kemudian ditambahkan. Suspensi Harus dibiarkan selama 30 menit untuk
memfasilitasi pencucian senyawa menjadi pelarut dan kemudian disaring. Proses ini
harus diulang dua atau tiga kali untuk memastikan pemulihan yang baik dari produk
alami. Jenis pelarut yang digunakan harus sedikit lebih polar daripada biasanya
diperlukan untuk melarutkan sampel dan sebagai contoh jika sampel mudah larut
dalam kloroform maka desorpsi harus dilakukan menggunakan CHCl3: MeOH (9: 1)
atau (8: 2 ). Ini harus memastikan pemulihan maksimum dari sorben dan
meminimalkan kemungkinan suatu produk sangat terikat pada fase padat.
(b) Sorbent kaya senyawa harus dimasukkan ke dalam corong kaca disinter (3 porositas
frit) melekat pada gelas Buchner dan bertanya di mana vakum diterapkan. Sorbent
 kemudian dicuci dengan pelarut dan larutan yang dihasilkan dapat diperoleh kembali
dalam larutan dan diuapkan untuk menghasilkan produk. Pencucian berulang dengan
pelarut akan memulihkan senyawa secara efektif dan ini adalah metode pilihan untuk
pemulihan dari pelat TLC prep.
(c) Pipet Pasteur diblokir dengan sejumlah kecil kapas kapas atau mikrokolom dengan
frit porositas 3 dapat dikemas dengan sorben kaya senyawa. Kolom “mini” ini
kemudian dapat dielusi dengan pelarut untuk memulihkan senyawa. Harus berhati-
hati untuk tidak membungkus kolom-kolom ini karena waktu pemilihan senyawa
mungkin cukup besar. Namun, satu manfaat dari metode desorpsi ini, dengan asumsi
bahwa produk alami yang menarik cukup stabil, adalah bahwa mereka dapat diatur
dengan pelarut yang memadai dan dibiarkan kering untuk jangka waktu yang lama
untuk memastikan pemulihan penuh produk alami.
Dalam ketiga kasus, di mana silika adalah sorbent, metanol dapat digunakan sebagai
tahap pencucian akhir untuk memastikan pemulihan senyawa penuh — banyak produk alami,
seperti glikosida flavonoid dan triterpenoid, sangat polar dan mungkin memerlukan penambahan
1 atau 2% asam asetat dalam elusi metanol akhir ini.

Produk harus dikeringkan dengan cepat setelah elusi lebih disukai menggunakan alat
peniup Dengan kemurnian tinggi 2 dan disimpan dalam freezer. Rotary evaporator menggunakan
panas dan turbovps menggunakan udara harus dihindari karena risiko penguraian dan oksidasi
panas. Bila jumlah residu pelarut terperangkap sebagai film dalam produk alami kering,
penggunaan pistol pengering, desikator vakum atau pengering beku akan memastikan bahwa
produk tersebut cukup kering untuk analisis spektroskopi (lihat Catatan 1)

3.4.8. Menilai Kemurnian dengan TLC

Setelah desorpsi, TLC analitik harus dilakukan pada pemulihan oleh TLC produk untuk
memastikan kemurnian. Ukuran partikel yang lebih kecil dari pelat analitik dibandingkan dengan
PTLC memungkinkan resolusi yang lebih baik dan kemampuan yang lebih besar untuk
mengukur kemurnian. Setidaknya dua pelarut yang berbeda. Sistem harus digunakan untuk
membedakan antara senyawa yang memiliki yang sama (atau identik!) Rf Nilai-nilai pada sistem
tertentu (lihat Catatan 2).

3.4.9. Keuntungan dan Kekurangan PTLC

Dalam 20 tahun terakhir, ada gerakan yang cukup jauh dari teknik "basah", seperti PTLC
dan kolom konvensional kromatografi, menuju teknik instrumental seperti HPLC, dan kontra
kromatografi saat ini. Banyak produk alami ahli kimia lebih suka metode instrumental ini karena
lebih besar kontrol atas proses pemisahan dan reproduktifitas yang mereka mampu Meskipun
biaya tinggi dan kebutuhan untuk servis rutin ini mesin akan memastikan bahwa peran penting
untuk PTLC dalam isolasi prosedur akan dipertahankan untuk beberapa waktu mendatang.
Keuntungan PTLC diuraikan di bawah ini.
(a) PTLC hemat biaya dibandingkan dengan metode instrumental, misalnya HPLC atau CCC.
(b) Teknik sederhana yang membutuhkan sedikit pelatihan atau pengetahuan tentang
kromatografi untuk digunakan
(c) Metode analitik dapat dengan mudah ditingkatkan menjadi preparatif metode
(d) Kemampuan untuk mengisolasi produk alami dengan cepat dalam miligram ke kisaran gram
(e) Fleksibilitas dari pilihan fase pelarut dan stasioner, yaitu, sistem pelarut dapat diubah dengan
cepat selama menjalankan
(f) Pemisahan dapat dioptimalkan dengan mudah untuk satu komponen, yaitu, relatif mudah
untuk "membidik" pada produk tertentu bunga
(g) Metode dikembangkan dengan cepat
(h) Hampir setiap pemisahan dapat dicapai dengan fase diam dan fase gerak yang benar
( i)Sejumlah besar sampel dapat dianalisis atau dipisahkan serentak
Kerugian dari PTLC adalah sebagai berikut.
(a) Kontrol deteksi yang buruk bila dibandingkan dengan HPLC
(b) Kontrol elusi yang buruk dibandingkan dengan HPLC
(c) Memuat dan kecepatan buruk dibandingkan dengan vakum-cair kromatografi
(d) Berbagai metode pengembangan untuk mengisolasi gram bahan mungkin memakan waktu
(e) Piring yang tersedia secara komersial terbatas pada sorben sederhana, seperti silika, alumina,
selulosa, dan RP-2

3.5. Sentrifugal Lapisan Tipis Preparatif Kromatografi

Teknik yang sangat baik dan kurang tereksploitasi ini dapat digunakan sebagai
"pembersihan" proses utama dari ekstrak produk alami atau sebagai akhir langkah pemurnian.
Kromatografi lapis tipis preparatif sentrifugal (CPTLC) menggunakan rotor kaca yang dilapisi
dengan sorben untuk membentuk pelat bundar yang kemudian ditempelkan pada spindel.
 Gambar 7

dan diputar menggunakan motor. Pelarut kemudian dimasukkan ke tengah pelat

melingkar oleh pompa untuk menyeimbangkan sorben. Piring harus jenuh dengan pelarut dan
dibiarkan seimbang pada diberikan laju aliran selama 10 menit. Campuran sampel kemudian
dapat dimasukkan ke piring dengan cara yang sama. Saat piring berputar dan pelarut bermigrasi
melalui sorben, sampel dipisahkan menjadi pita senyawa sirkular yang dapat dikumpulkan
dengan mudah.
Pelat dan motor ditempatkan dalam peralatan, di mana atmosfer nitrogen dapat
diterapkan. Contoh yang sangat baik dari CPTLC aparatur adalah Chromatotron (Harrison
Research Model 7924), yang memiliki saluran untuk mengumpulkan eluting band dan jendela
kuarsa itu dipasang di atas piring memungkinkan visualisasi piring dengan UV cahaya.
CPTLC memiliki sejumlah keunggulan dibandingkan PTLC, pertama, karena
pengembangan dipercepat oleh rotasi pelat, pemisahan sangat cepat. Kedua, perubahan pelarut
dapat dilakukan dengan cepat dan seseorang dapat beroperasi dalam mode gradien atau isokratik.
Lebih besar jumlah material (1-2 g) dapat dimuat ke piring dalam satu jalankan yang tidak selalu
memungkinkan dengan PTLC. Seperti buatan rumah piring persiapan, pelat CPTLC
memungkinkan pilihan sorben, aditif, dan pengikat yang dapat disesuaikan untuk kelas tertentu
senyawa.
Cara untuk membuat berbagai piring dengan sorben berbeda menemani manual peralatan
CPTLC; namun, pelat gel silika dengan ketebalan 2 atau 4 mm dapat dibuat dengan cara berikut.
1. Tambahkan silika (Kieselgel 60 PF 254 Merck 7749) (65 atau 100 g; untuk 2 atau ketebalan
4 mm) dan pengikat (CaSO 4 ; 4 atau 6 g) hingga disuling air (100 atau 190 mL) dan kocok
sampai bersih.
2. Tuang bubur yang dihasilkan ke rotor di bagian tepi dan piring disadap dengan lembut untuk
menghilangkan gelembung udara dan untuk memastikan lapisan homogen.
3. Keringkan udara selama 30 menit dan keringkan oven pada suhu 50 ° C selama 12 jam.
Piring yang dihasilkan kemudian harus dibuang sesuai kebutuhan ketebalan dan disimpan
dalam oven pada suhu 50 ° C sebelum digunakan.

Pilihan sistem pelarut yang benar harus dipastikan oleh menggunakan serangkaian pelat
analitik dengan pelarut yang semakin polar
 Ailanthinone R = COCH(Me)CH2CH3 2'-Acetylglaucarubinone
R = COC(OAc)(Me)CH2CH3 (Silica gel; CH2Cl2:isopropanol (49:1))

8-Hydroxycanthin-6-one [Silica gel; toluene:EtOAc:AcOH (5:4:1)]

tentukan nilai Rf. Saat menggunakan sistem isokratik, sistem pelarut di mana Rf dari
senyawa polar paling sedikit adalah 0,3 dapat digunakan. Ini akan menghasilkan pemisahan yang
stabil di mana fraksi (dan pita senyawa) dapat dikumpulkan dan dianalisis dengan TLC. Sistem
yang lebih polar (mis., Rf dari komponen polar terkecil adalah 0,8) dapat digunakan di mana
senyawa terkonsentrasi akan muncul sebagai band diskrit yang bergerak cepat melalui pelat dan
fraksi volume yang lebih kecil harus dikumpulkan dan dianalisis. Seperti halnya dengan PTLC,
penggunaan sorben yang menggabungkan indikator UV akan membantu dalam pemantauan
senyawa UV aktif.
Khan dan rekan kerja (11) menggunakan alat CPTLC Chromatotron dalam pemisahan
beberapa diterpen clerodane yang tidak biasa (Gbr. 8) dalam studi kemotaksonomi spesies fl
acourtiaceae spesies Zuelania guidonia. Sorben gel silika dan fase gerak dari petrolEtOAc (49: 1)
digunakan dan senyawa divisualisasikan di bawah sinar UV.
 Waterman dan Ampofo (1984) (12) menggunakan CPTLC untuk mengisolasi quassinoid
sitotoksik ailanthinone, 2 ¢ -acetylglaucarubinone dan alkaloid 8-hydroxycanthin-6-one dari
pohon hutan hujan Odyendyea gabonensis (Simaroubaceae) (Gbr. 9).

3.6. Lebih dari Tekanan Lapisan tipis Kromatografi

Over Pressure Thin-Layer Chromatography (OPTLC) adalah diperkenalkan oleh Tyihak
et al., pada 1979 (13) dalam upaya menggabungkan keunggulan TLC konvensional dan HPLC.
Teknik ini mempekerjakan penggunaan ruang ultra-mikro melingkar bertekanan (PUM chamber)
yang menampung pelat TLC dan lubang masuk untuk Pengenalan sampel dan pelarut ke sorben.
Yang kurus lapisan sorben ditutupi oleh membran yang disimpan di bawah tekanan eksternal
sehingga fase uap di atas sorben hampir dihilangkan. Diperlukan waktu yang jauh lebih singkat
untuk pemisahan daripada di TLC konvensional dan kromatografi kolom klasik (CC) dan
resolusi dan efisiensi pemisahan yang lebih besar tercapai. Itu tingkat di mana pelarut bermigrasi
sama stabilnya dengan HPLC dan akibatnya teknik ini dapat digunakan untuk memodelkan
metode C. Pemisahan dapat dilakukan 5-20 kali lebih cepat daripada konvensional TLC dan
metode ini mungkin berlaku untuk sejumlah besar campuran. Tyihak et al. memvalidasi teknik
ini menggunakan pemisahan pewarna sintetis indophenol, Sudan G dan Butter Yellow. Produk
alami, seperti capsaicin dari Capsicum annuum dan furocoumarin dari Heracleum sphondylium
juga pernah ada dipisahkan oleh Nyirdey et al. (14)

3.7. Otomatis Pengembangan Berganda

Metode ini menggunakan ruang pengembangan yang sepenuhnya otomatis terdiri dari
sensor untuk mendeteksi posisi depan pelarut secara optik, mekanisme untuk mengangkat piring
keluar dari ruang pengembangan, beberapa reservoir pelarut, pompa pelarut, dan kipas
terintegrasi untuk mengeringkan piring dan menghilangkan uap pelarut. Sistem modern
mengandung pemrograman dikendalikan mikroprosesor untuk memvariasikan komposisi pelarut
setelah setiap kali dijalankan. Berbagai perkembangan meningkat secara dramatis kekuatan
pemisahan, meningkatkan reproduksibilitas dan presisi dan dapat dijalankan tanpa pengawasan.
Alat ini juga dapat digunakan di bersama dengan pemindai pelat TLC yang akan mendeteksi UV
aktif band. Ini dapat dihubungkan dengan PC dan dihubungkan ke printer untuk hard copy.
Contoh yang sangat baik dari multiple otomatis perangkat pengembangan (AMD) adalah sistem
AMD CAMAG

3.8. Dua dimensi TLC

TLC dua dimensi sering digunakan untuk penyaringan campuran kompleks. Jika
objeknya adalah untuk menemukan senyawa dan standar yang dikenal tersedia, maka ini adalah
bentuk TLC yang kuat. Ekstrak terlihat ke piring dengan cara normal dan piring dikembangkan,
dikeringkan, dan kemudian diputar hingga 90 ° dan dikembangkan a kedua kalinya (Gbr. 10). Ini
memiliki keuntungan menyelesaikan senyawa ke dimensi kedua yang memberikan resolusi lebih
lanjut. Juga sistem pelarut yang berbeda dapat digunakan untuk elusi kedua yang selanjutnya
meningkatkan kekuatan penyelesaian dari teknik ini. Itu kromatogram yang dihasilkan kemudian
dapat diamati di bawah sinar UV atau diwarnai untuk tujuan deteksi.

Teknik ini dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan varietas metabolit tanaman dan
membantu dalam taksonomi tanaman atau menilai kualitasnya dengan ada atau tidak adanya
phytochemical tertentu. Metode ini telah digunakan untuk menganalisis ekstrak akar ginseng
Amerika (Panax quinquefolius) (15), yang kaya akan triterpene glikosida, yang dikenal sebagai
ginsenosides. Metode menggunakan dua sistem pelarut, yang pertama mengandung CHCl 3-
MeOH-air (13: 7: 2) dalam arah pertama diikuti oleh sistem pelarut kedua yaitu air-n-butanol-
EtOAc (5: 4: 1) di arah kedua. Ini menunjukkan kekuatan TLC 2 dimensi karena ada banyak
metabolit hadir dalam ginseng dan komponennya bersifat polar dan kompleks secara kimiawi
dan dapat diatasi dengan menggunakan teknik ini.
Review yang sangat baik oleh Cieśla dan Waksmundzka-Hajnos (16) tentang hal ini
menjelaskan contoh - contoh dari analisis kumarin, asam fenolik, fl avonoid, alkaloid, triterpen,
dan antrakuinon.

3.9. Performa Tinggi TLC

Teknik ini menggunakan pelat yang memiliki partikel adsorben ukuran dan pelat analitik
biasanya memiliki ukuran rata-rata 5 mm dibandingkan dengan 15 mm untuk pelat rutin. Ini
menghasilkan resolusi pita, kecepatan, dan efisiensi yang lebih tinggi. TLC berkinerja tinggi
(HPTLC) sering merupakan proses otomatis menggunakan instrumentasi untuk memfasilitasi
beberapa pengembangan dan deteksi menggunakan densitometri dan pencitraan untuk
mengambil gambar elektronik dari pita-pita yang terpisah. Teknik ini memiliki penerapan luas
dalam analisis alami campuran produk dan isolasi senyawa yang ditingkatkan.
HPTLC dapat digunakan untuk mengidentifikasi tanaman yang digunakan sebagai obat
tradisional, terutama campuran kompleks yang dihasilkan dari Obat herbal Cina. Teknik ini juga
dapat digunakan untuk menilai kualitas obat herbal dan untuk mengukur apakah sampel telah
diubah atau dipalsukan (penambahan bahan kimia asing) dengan cara apa pun. HPTLC juga telah
digunakan untuk mendeteksi produk alami beracun, seperti gliotoxin, yang merupakan produk
alami penekan kekebalan yang kuat Diproduksi oleh berbagai jamur patogen, seperti Aspergillus
(17). Analisis sampel biologis, seperti urin untuk mengevaluasi keberadaan zat terkontrol seperti
cannabinoid juga telah dilakukan dilakukan oleh HPTLC (18). Kedua contoh ini menunjukkan
utilitas dan penerapan teknik ini dalam evaluasi klinis dan toksikologi. HPTLC adalah teknik
yang benar-benar luar biasa dan pembacanya didesak untuk berkonsultasi tinjauan penting oleh
Reich dan Widmer (19) pada bagian kromatografi planar yang berharga ini.

3.10. Analitik dan Preparative-TLC, Beberapa Produk Alami Contohnya

Mayoritas contoh mencakup kelas senyawa dari tanaman sumber (Tabel 4–8). Hanya
tahap akhir persiapan TLC yang diberikan dalam isolasi dan rincian lebih lanjut dapat diperoleh
dari referensi.

3.11. TLC Bioassays

Kesederhanaan TLC dan kemampuan teknik ini untuk terpisah mencampur dengan cepat
dengan sedikit biaya berarti mudah digunakan untuk mendeteksi aktivitas biologis komponen
yang terpisah. Sejumlah tes ini dijelaskan dalam literatur dan mayoritas bergantung pada
senyawa yang terpisah memberikan reaksi warna dengan disemprotkan reagen baik sebagai
langkah akhir atau sebagai konsekuensi dari enzim aktivitas, reaksi kimia, atau aktivitas
organisme. Tes ini mudah dikembangkan dan dilakukan dan contoh diberikan di bawah ini.

3.11.1. TLC antioksidan Pengujian kadar logam

Zat antioksidan adalah komponen penting dari diet dan itu diakui secara luas bahwa
mereka berkontribusi pada kondisi yang sehat. Ada banyak bukti yang menunjukkan bahwa
antioksidan penting dalam menghambat kemunculan dan proliferasi sel kanker dan akibatnya Uji
TLC yang mendeteksi aktivitas ini bermanfaat.
Erasto et al. (48) menyelidiki sifat antioksidan fl avonoid menggunakan radikal DPPH
(2,2-difenil-1-pikrillhidrazil). Senyawa ini adalah radikal yang stabil dan di hadapan radikal
pemulung (antioksidan) itu diubah dari ungu menjadi kuning warna. Perbedaan warna yang
kontras ini sangat berbeda dan memungkinkan pengenalan zat antioksidan dengan mudah.
Gambar 11 menunjukkan contoh senyawa antioksidan yang diisolasi menggunakan teknik ini
dan ini mungkin karena sifat fenoliknya kelompok dapat membentuk radikal bebas. Aktivitas
antioksidan mereka ditemukan dengan menjalankan pelat TLC dengan sampel-sampel ini dengan
konsentrasi berkisar antara 0,1 hingga 100 mg. Piring-piring itu kemudian dikeringkan dan
disemprot dengan larutan DPPH (2 mg / mL dalam MeOH) dan dibiarkan setengah jam.
Senyawa antioksidan muncul sebagai bintik kuning dengan latar belakang ungu (48).

3.11.2. Asetilkolin Esterase TLC Assay

 Inhibitor dari enzim asetilkolin esterase meningkatkan kadar neurotransmitter ini pada
sinapsis di korteks serebral dan ini memiliki manfaat bagi pasien yang menderita penyakit
Alzheimer (49). Galanthamine (Gbr. 12), produk alami dari tetesan salju.

Tabel 4

Isolusi produk alam (terpenoid) dan cromotografi planar

Senyawa dan sumber

( referensi ) Struktur Kondisi kromotografi

Sesquiterpene Dari Silika gel,toluene : EtOAc (96:4)

Bronia inornata (20) then toluene : ErOA (92:8)

Sesquiterpene Dari Silika gel, Mc₂CO:hexane (4:1)

Calea divaricate (21)

Diterpene Dari Silika gel, heksan:CHCI₃:EtOAc

Leonitis Ocymifolia (2:3:2)
(22)
 Diterpene Dari Silika gel, CH₂CI₂:EtOAc (94:6)
Cupressus goveniana
(23)

Diterpene Dari Silika gel, toluen : EtOAc:AcOH

Casearia Tremula (88:10:2) (two developments)
(24)

Steroidal triterpene Silika gel, petroleum

Dari Sabal black ether:EtOAc(4:1), two
burniana (25) developments

Bilobalide Dari Silika gel, CHCI₃:Me₂CO:HCO₂H

Gingko biloba (26) (75:16.5:8.5)

(Galanthus nivalis) digunakan sebagai penghambat enzim ini dalam pengobatan penyakit ini dan
dipasarkan sebagai terapi untuk meningkatkan kognisi pada pasien Alzheimer.

Dalam pengujian ini, pelat TLC dijalankan dengan inhibitor prospektif (misalnya, galanthamine,
physostigmine, atau pengembangan plat dikeringkan dengan hair-dyer untuk memastikan penghapusan
lengkap pelarut yang berkembang. Piring tersebut kemudian disemprot dengan larutan stok dari
acctylcholine esterase (1.000 U dilarutkan dalam 150 mL buffer asam tris-hidroklorat 0,05 M pada pH
7,8 dengan albumin serum sapi (150 mg) yang ditambahkan untuk menstabilkan enzim selama
pengujian). Piring TLC kemudian ditempatkan di ruang air yang lembab.

Selama 20 menit sambil memastikan bahwa air tidak menyentuh lempeng. Untuk mendeteksi
enzim, dua larutan disiapkan terlebih dahulu: (1) 1-naphthyl acctate (250 mg) dalam cthanol (100 mL)
dan (2) Garam B Cepat Biru (400 mg ) dalam air suling (160 mL). Setelah inkubasi pelat selama 20 menit,
10 mL larutan naphthyl acetate dan 40 mL larutan garam Fast Blue B dicampur bersama dan
disemprotkan ke TLC untuk memberikan warna ungu. inhibitor esterase acctyl choline hadir, w latar
belakang hite dari tempat TLC jelas.

Tabel 5

Isolasi produk alam (glikosida) oleh kromatografi planar

Senyawa dan sumber

( referensi ) Struktur Kondisi kromotografi

Glikosida Dari Castileja Alumina, n-BuOH:H₂O:McOH

Rhexifolia (27) (7:3:1)

Glikosida Dari Paeonia Silika gel, CHCI₃:McOH:H₂O

emodi (28) (80:19.5:0.5)

Glycoside Dari Gunnera Silika gel, McOH:CHCI₃ (3:17)

Perpensa (29)
Glycoside Dari Silika gel, ErOAc:McOH (1:1)
Homalium Longifolium
(30)

Uji ini bekerja dengan mengubah naphthyl acetate menjadi alpha naphthol oleh acctyl choline
esterasc dan alpha-naphthol kemudian bereaksi dengan garam Fast Bluc B untuk menghasilkan azo dyc
ungu (49). Ketika esterase acctylcholine dihambat, produksi alpha-naphthol dihentikan dan oleh karena
itu produksi pewarna azo ungu adalah inlhibitcd. Marston et al. (49) telah menunjukkan bahwa
physostigminc menghambat enzim pada 0,001 ug dan galanthamine pada 0,01 ug, menunjukkan bahwa
uji ini sensitif terhadap vcry. Para penulis menyatakan bahwa pengujian ini cepat.

Tabel 6

Isolasi produk alami ( Coumerin, Lignan, Polykeside, dan azaphilone ) dengan

kromatografi planar

Senyawa dan sumber

( referensi ) Struktur Kondisi kromotografi
Coumarin Dari Silika gel,CHCI₃:EtOAc (9:1)
Asterolasia two developments
drummondita (31)

Lignan Dari Imperata Silika gel, C₆H₆:EtOAc(1:1)

Cylindrica (32)

Polyketide Dari Silika gel, (1) petroleum

Seiridium sp. (33) ctheriacetone,(6:4),(2)
CHCI₃:iso-propanol (9:1)
Azaphilone Dari Silika gel, CH₂CI₂:McOH (19:1)
Penicillinum
Sclerotiorum (34)

Sederhana, dan mudah untuk mendalilkan bahwa bioassay ini dapat diperluas ke enzim
lain sebagaimana berlaku untuk beberapa sampel sekaligus. Mereka juga selama enzim stabil di
bawah kondisi pengujian. Konsep TLC ini ditambah enzim untuk bioassay telah digunakan
dalam evaluasi keberadaan senyawa organofosfat inskctisidal dalam jus buah dan melayani
pengujian (50). menggunakan HPTLC dan bioassay TLC esterase terhadap jamur dan bakteri
telah terbukti sangat populer pada tingkat penggunaan, biaya, kecepatan, dan karena kemampuan
mereka untuk ditingkatkan untuk menilai aktivitas antimikroba pada tingkat tinggi.

Tabel 7

Isolasi produk alam ( alkaloid ) dari kromatograpi planar

Senyawa dan sumber

( referensi ) Struktur Kondisi kromotografi

Alkaloid Dari Eriostemon Silika gel, (1) Hexane :EtOAc, 8:2 (2)
gardneri (26) CHCI₃:EtOAc, 8:2

Alkaloid Dari Papaver Silika gel, CHCI₃: McOH,8:2

Somniferum (35)

Alkaloid Dari Berberis sp. Silika gel, (1) CHCI₃:McOH:NH₄OH

(36) (90:10:1). (2)
C₆H₆:Mc₂CO:McOH:NH₄OH
(45:45:10:1)
Alkaloid Dari Citrus Silika gel, C₆H₆:EtOAc, (19:1)
decumana (37)

Alkaloid Dari Aconitum Alumina, Mc₂CO:hexane (45:55)

Forrestii (38)

Alkaloid Dari Sternbergia Silika gel, CHCI₃:McOH (9:1)

lutea (39)

Alkaloid Dari Thalictrum Silika gel, Cyclohexane:

Faberi (40) EtOAc:diethylamine (6:4:1 to 8:4:1)

Tabel 8

Isolasi produk alam ( fenol dan flovanoid ) dari kromatografi

Senyawa dan sumber

( referensi ) Struktur Kondisi kromotografi

Isoflavone Dari Derris scandens Silika gel, Mc₂CO:CHCI₃ (2:98)

(41)

Flavonoid glycoside Dari pices Silika gel, n-BuOH-AcOH:H₂O

abies (42) (4:1:5)
Antharaquinone dimer Dari Silika gel, CHCI₃:McOH (100:2)
Senna multiglandulosa (43)

Norlignan Dari Asparagus Silika gel CHCI₃

gobicus (44)

diaryIheptanoid Dari Dioscorea ODS (reverse Phase)

spongiosa (45) McOH:H₂O (5:2)

Dihydrodibenzodioxinone Dari Silica gel, 35% EtOAc in

Hypericum X Hidcote (46) hexane followerd by 30%
EtOAc in toluene

Dihydrodibenzodioxinone dari Silica gel, toluene-ethyl

Hypericum revolutum ssp. Acetate-acetic acid (80:18:2)
Revolutum (47)

Pyranone Dari Hypericum Silica gel,toluene-ethyl

Choisianum (47 ) acetate-acetic acid (80:18:2)
 Gambar 11. Senyawa antioksidan diidentifikasi oleh TLC.

Gambar 12. Struktur galantamin

Jumlah sampel. Pada umumnya, piring TLC dijalankan dan kemudian mikroorganisme
dimasukkan ke dalam piring sebagai semprotan (dalam kasus biografi langsung). atau piring
ditutupi dengan media pertumbuhan yang mengandung mikroorganisme dalam piring atau baki
(uji overlay). Dengan terjadinya beberapa bakteri yang resistan terhadap obat (seperti
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)) dan kebutuhan akan obat antijamur baru,
terutama dengan aktivitas melawan resisten Spesies Candida dan Sryptococcus, bioassay
sederhana ini terus terbukti bermanfaat dalam penilaian aktivitas antimikroba dari ekstrak produk
alami. Sebuah tinjauan terhadap tes antijamur dan antibakteri telah dilakukan oleh Cole (51) dan
pembaca tersebut dirujuk ke sejumlah penulis, yaitu Spooner dan Sykes (52), Holt (53), Rios et
al. (54), Homans and Fuchs (55), Betina (56) Ieven et al. (57), dan Begue dan Kline (58).

(a) TLC bioautografi langsung. Teknik ini dapat digunakan dengan jamur atau bakteri
pembentuk spora dan dapat digunakan untuk melacak aktivitas melalui proses pemisahan. Ini
adalah tes yang sangat sensitif dan memberikan lokalisasi senyawa aktif yang akurat (59).
Untuk penilaian aktivitas antijamur, patogen tanaman Cladosporium cucumerinum (IMI-
 299104) dapat digunakan karena sifatnya non patogen bagi manusia, mudah membentuk
spora dan dapat mudah ditanam di piring TLC dengan media yang benar. Metode sederhana
diuraikan sebagai berikut :

1. Ekstrak atau senyawa murni dapat dilihat pada piring TLC analitik dalam rangkap. dua
(didukung plastik, Kieselgel 60 PF 254, Merck Art 5735), dikembangkan dengan fase
gerak yang sesuai dan dikeringkan.

2. Siapkan kemiringan C.cucumerinum (IMI-299104) dari kultur dan biarkan bersporulasi

selama 2 hari.

3. Media pertumbuhan TLC yang harus disiapkan sebagai berikut: NaCl (1 g), KH2PO4 (7
g), Na2HPO 2.2H2O (3 g), KNO3 (4 g), MgSO4 (1 g), dan Tween 80 (20 tetes)
ditambahkan ke dalam air (100 mL). Alikuot (60 mL) dari larutan ini harus ditambahkan
10 mL glukosa berair steril (30%) b / v).

4. Disiapkan suspensi jamur lalu ditambahkan larutan ke lereng jamur dan dikocok.

5. Suspensi harus disemprotkan ke salah satu TLC piring dan diinkubasi pada suhu 25 °C
selama 2 hari dalam baki pengujian dengan menggunakan kapas basah untuk memastikan
suasana agar tetap lembab.

6. Pelat TLC diinokulasi dan harus diamati secara teratur dengan interval dan adanya
senyawa antijamur ditandai dengan penghambatan atau berkurangnya pertumbuhan
miselia. Ini sering diamati sebagai bintik-bintik cahaya dengan latar belakang hijau gelap.
Penyemprotan ini harus dilakukan di kabinet aliran laminar.

7. Pelat TLC yang tersisa harus divisualisasikan menggunakan pereaksi semprotan dan /
atau deteksi UV dan dibandingkan dengan pelat yang diinkubasi.

Aspergillus niger, jamur yang lebih mudah bersporulasi yang dapat digunakan sebagai
pengganti Cladosporium sp. tetapi kita harus hati-hati dengan organisme ini karena beresiko
terkena aspergillosis dan semua mikroba harus ditangani secara aseptik dalam kabinet aliran
lamina. Kontrol senyawa dilakukan untuk mengukur konsentrasi penghambatan minimum
(MIC) (51).

Mengisolasi sesquiterpen antijamur aristolen-2-satu dan prostantherol (Gbr. 13) dari dua
spesies Prostanthera (Lamiaceae). Aktivitas dinilai dan dilacak melalui prosedur pemisahan
dengan menggunakan bioautografi langsung dengan C. cucumerinum sebagai target jamur.
Aristolen-2-one menghambat pertumbuhan C. cucumerinum selama 70 jam dengan dosis 1 mg
dan prostantherol menyebabkan penghambatan pada 10 mg untuk durasi yang sama.
 Gambar 13. Struktur seskuiterpen antijamur aristolen-2-one dan prostantherol.

Gambar 14. Xanthones antijamur.

Aktivitas antijamur dari banyak senyawa fenolik tanaman dapat dengan mudah dinilai
dengan menggunakan prosedur sederhana ini. Hostettmann dan Marston (61) menyelidiki
serangkaian xanthones (Gbr. 14) dari Hypericum brasiliense (Guttiferae) juga untuk aktivitas
melawan C. cucumerinum. Salah satu dari senyawa ini (sebelah kiri Gambar. 14) menunjukkan
dosis penghambatan rendah (0,25 mg) yang mungkin memerlukan penyelidikan lebih lanjut dari
fungsi antijamur senyawa yang menarik ini.

(b)Uji lapisan atas TLC bioautografi. Pada Uji ini, ekstrak atau senyawa murni dijalankan pada
pelat TLC yang kemudian ditutup oleh media yang diunggulkan dengan mikroorganisme yang
sesuai. Seperti halnya tes bioautografi langsung, jamur dan bakteri dapat diselidiki. Rahalison et
al. (59) telah menerapkan teknik ini untuk evaluasi ekstrak antimikroba terhadap ragi Candida
albicans dan bakteri Bacillus subtilis. Pengujian lapisan atas sederhana menggunakan
Staphylococcus aureus dilakukan sebagai berikut :

1. Basis agar nutrien (NA) (Oxoid) harus dituangkan ke dalam piring uji dan dibiarkan diatur.

2. Ekstrak, fraksi, atau senyawa murni harus dijalankan menggunakan piring TLC (duplikat)
dengan pengembangan yang sesuai pelarut. Salah satu pelat ini harus divisualisasikan di
bawah sinar UV dan kemudian diwarnai untuk mengamati senyawa yang dikembangkan.
Nilai Rf harus diukur secara akurat.

3. Inokulum S. aureus pada larutan 10^9/ mL dalam Mueller Hinton Broth (MHB) harus
disiapkan dan agar nutrien ditambahkan pada 7,5 g / L untuk mengentalkan medianya. Dan
kemudian diencerkan dengan MHB untuk memberikan konsentrasi larutan terakhir dari 10 5
cfu / mL.

4. Pelat TLC yang tersisa harus ditempatkan pada alas NA dan media yang mengandung
organisme uji dituangkan di atas pelat dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam.

5. Di sekitar antibakteri muncul dengan tanda bintik-bintik yang jelas dengan latar belakang
koloni bakteri. Di daerah sekitarnya dapat divisualisasikan lebih jelas dengan menggunakan
garam tetrazolium (4 mg /mL dalam MeOH) (seperti piodonitrotetrazolium chloride (INT)
atau methylthiazoyltetrazolium chloride (MTT)) yang menunjukkan aktivitas dehidrogenase
bakteri laktat. Larutan ini dapat disemprotkan ke permukaan media. Zona dari
penghambatan (dan karenanya senyawa antimikroba) muncul sebagai zona yang jelas
dengan latar belakang ungu.

6. Zona hambatan harus dibandingkan dengan yang sebelumnya. Pelat TLC yang sudah
dikembangkan sebelumnya sehingga metabolit aktif dapat mudah diidentifikasi dan jika
perlu, diisolasi.

7. Zat kontrol yang tepat, seperti ampisilin atau kloramfenikol, yang harus digunakan.

Bakteri yang resistan terhadap obat, seperti MRSA perlu dikultur di hadapan metisilin
untuk meminimalkan risiko kehilangan resistensi.

Batista et al. (62) menggunakan metode overlay dalam fraksionasi yang dipandu oleh uji
dari ekstrak aseton dari akar Plectranthus hereroensis (Lamiaceae) untuk mengisolasi antibakteri
yang diterpen (Gambar 15). S. aureus digunakan sebagai tes organisme. Senyawa ini kemudian
dinilai dalam uji pengenceran kaldu dan ditemukan memiliki MIC 31,2 mg / mL..

Hamburger and Cordell ( 63) menggunakan uji iniuntuk menyelidiki aktivitas sterol dan
senyawa fenolik tanaman. Hamparan kaldu nutrisi yang mengandung
organisme uji disebarkan di atas pelat TLC lalu diinkubasi. Menariknya, pengujian ini tidak
sensitif untuk beberapa orang senyawa sitotoksik, termasuk camptothecin, glaucarubolone, dan
b-peltatin saat diuji pada 5 mg.

4. Catatan

1. Prosedur untuk menghilangkan sorben (terutama silika dan alumina) dari lapisan pelat
TLC harus selalu dilakukan dalam lemari uap dan masker debu harus dipakai untuk
menghindari pernafasan dalam bahan partikulat yang berbahaya.

2. Perlu dicatat bahwa jika senyawa yang dipulihkan tampaknya tidak murni setelah apa yang
dijanjikan akan berhasil dimurnikan PTLC, maka ada kemungkinan bahwa produk alami
tidak stabil pada sorben atau dalam larutan dan stasioner alternatif fase atau proses
pemisahan harus dicari.

3. Amfoterisin B sangat toksik dan perawatan harus dilakukan dalam penggunaannya.

PEMBAGIAN TUGAS MASING-MASING TIAP ORANG

AS’AD = Menerjemahkan Hal. 117-122 + Hal. 123 (AKTIF)

ASA ANNISA = Menerjemahkan Hal. 129-134 + Hal. 126 (AKTIF)

FITRI RAMADANI = Menerjemahkan Hal. 141-146 + Hal. 124 (AKTIF)

NURFEBIYANTI YUSUF = Menerjemahkan Hal. 147-151 + Hal. 127-128, Menyatukan hasil

translate (AKTIF)

NUR RAHMI = -- (TIDAK AKTIF)

REZKY SEPTIAH R = Menerjemahkan Hal. 135-140 + hal. 123 (AKTIF)

RUSNIA = Mengerjakan PPT (AKTIF)