Paraf Asisten

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ORGANIK

Judul : Ekstraksi Pigmen dan Analisa TLC-nya

TujuanPercobaan :

1. Mempelajari teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari sampel padatan

2. Mempelajari teknik analisa Thin Layer Chromatography (TLC)

Pendahuluan

Karotenoid merupakan pigmen alami yang larut dalam lemak yang ditemukan pada
tumbuhan besar, ganggang, jamur dan bakteri dalam jaringan fotosintesis maupun non
fotosintesis. Karotenoid masuk dalam golongan terpenoid yang memberikan warna merah
cerah, oranye, atau warna kuning pada banyak sayuran dan berfungsi sebagai antioksidan dan
dapat menjadi sumber untuk aktivitas vitamin A. Karotenoid merupakan lipid sehingga
pigmen ini bersifat liposolubel (larut dalam lemak) dan larut dalam pelarut non polar. Secara
struktur karotenoid merupakan poliena dengan rantai terkonjugasi linier dari atom-atom
karbon yang berhubungan dengan ikatan rangkap dua dan tunggal. Karotenoid tersusun atas 8
unit isoprena yang terhubung satu sama lain dengan bentuk geometris jika diputus pada
tengah strukturnya.
H3C
CH3 CH3
H3C CH3

H3C CH3
CH3 CH3
CH3

Gambar 1. Karotenoid
(Gross, 1991).
Karotenoid di alam berfungsi sebagai energi pendisipasi pada sel fotosintesis dalam
pusat reaksi. Tanpa adanya karotenoid, energi yang ditangkap oleh klorofil melalui
penyerapan sinar matahari terakumulasi secara berlebihan. Kelebihan energi tersebut dapat
dilepaskan kembali ke alam oleh molekul karotenoid (dalam bentuk cis-). Penyerapan sinar
yang berlebihan akan mengubah karoten dari bentuk singlet menjadi triplet. Klorofil dalam
kondisi triplet sangat berbahaya karena memicu adanya singlet oksigen yang merupakan
radikal bebas yang akan merusak sel tersebut. Karoten menangkap triplet klorofil dan
mengubah singlet oksigen menjadi oksigen normal (Frank, 1995).
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi
dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase yaitu fase diam dan fase
gerak. KLT digunakan untuk dua tujuan yaitu dapat dipakai selayaknya sebagai metode untuk
mencapai hasil kualitatif, kuantitatif dan preparatif serta dapat dipakai untuk menjajaki
sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam KLT cair kinerja tingggi. Fase
diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat
komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal,
sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat
(Gritter,1991).
Pemilihan teknik kromatografi berdasarkan pada sifat kelarutan senyawa yang akan
dipisahkan. Kromatografi lapis tipis menggunakan lapisan tipis adsorben halus yang
tersangga pada papan kaca, aluminium atau plastik sebagai pengganti kertas. Fase diam
berupa silika jel. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan
senyawa yang dianalisis. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida atau hidrokarbon yang sukar. Komponen yang
dipisahkan harus larut dalam fase gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi
dengan fase diam dengan cara melarut didalamnya, teradsorpsi, atau bereaksi secara kimia
(Gritter, 1991).
Asas penting dalam kromatografi adalah bahwa senyawa yang berbeda mempunyai
koefisien distribusi yang berbeda. Senyawa yang berinteraksi lemah dengan fase diam akan
bergerak lambat. Setiap komponen dalam campuran senyawa bergerak dengan laju yang
berbeda dalam sistem kromatografi. Permukaan fase diam memiliki kemampuan untuk
menjerap senyawa organik. Pemisahan kromatografi yang baik akan diperoleh jika fase diam
mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya sehingga terjadi kesetimbangan yang baik
antara fase gerak dan fase diam. Fase gerak harus bergerak dengan cepat sehingga difusi
menjadi sekecil-kecilnya (Gritter, 1991).

Prinsip Kerja

Sampel dalam bentuk padatan diekstrak dengan pelarut organik dan dipisahkan
menggunakan teknik analisa Thin Layer Chromatography (TLC) yaitu berdasarkan
perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan (eluen).
Alat

Alat yang digunakan antara lain mortar, pestel, spatula, tabung reaksi, chamber TLC,
gelas ukur, pipet tetes, pinset, penggaris, lampu UV.

Bahan

Bahan yang digunakan antara lain aseton, kertas saring, pelarut aseton : heksana (3:7),
lempeng silika.

Prosedur Kerja

1. Preparasi sampel. Potong-potong kecil 5 gram sampel (daun, buah atau umbi) yang
sudah bersih dan kering (dengan jumlah air minimum). Gerus sampel menggunakan
mortar dan pestle dengan menambahkan aseton 5 mL. Dekantasi larutan ekstrak sambil
peras padatan yang tersisa menggunakan spatula (pada dinding mortar) hingga ekstrak
aseton maksimum yang diperoleh atau gunakan bantuan kertas saring untuk memeras
pasta tersebut.
2. Masukkan ekstrak dalam tabung reaksi atau vial 5 mL (sampel 1).
3. Siapkan kolom kromatografi dengan melarutkan atau membentuk bubur silika terlebih
dahulu. Kemudian bubur silika dimasukkan kedalam kolom (pipet Pasteur yang telah
disumbat dengan kapas pada bagian ujung bawahnya). Alirkan eluen atau pelarut
aseton:heksana (3:7) kedalam kolom silika sehingga penampakan packing kolom baik
dan rapat.
4. Masukkan sampel 1 sebanyak 1 mL kedalam kolom, lalu lewatkan eluen jika sampel
sudah tersisa sedikit diatas kolom. Tampung isolat pigmen (sampel 2) dalam gelas ukur
sesuai dengan warna pita ekstrak yang lewat dalam kolom.
5. Siapkan chamber TLC dan tempatkan pelarut aseton:heksana (3:7) kira-kira setinggi 0.5
cm. Tempatkan lempeng silika ukuran tertentu, yang sebelumnya telah ditotolkan sedikit
sampel ekstrak: sampel 1 dan sampel 2 ( 1 cm dari batas bawah kertas), pada TLC
chamber. Lalu tutup chamber dan tunggu pergerakan pelarut hingga sampai batas atas (
0.5 cm dari batas atas kertas). Ambil lempeng dengan menggunakan pinset dan
keringanginkan.
6. Jika sudah kering, amati pemisahan pigmen yang terjadi pada lempeng menggunakan
sinar UV. Ukur jarak yang ditempuh senyawa dan pelarut tersebut. Hitung faktor retensi
(Rf) untuk masing-masing komponen.
Waktu yang dibutuhkan

Preparasi sampel : 30 menit

Analisa TLC : 1 jam

Data Pengamatan

Massa tomat (sampel) = 5,08 g

Massa silika = 2,03 g
Panjang plat KLT dari batas bawah = 3,7 cm
Fraksi I (kuning) = 1,1 cm
Fraksi II (oranye tua) = 0,4 cm
Fraksi III (oranye) = 0,5 cm
Fraksi IV (kuning tua) = 0,7 cm

Hasil

Tabel hasil nilai Rf

Fraksi I Fraksi II Fraksi III Fraksi IV

(Kuning) (Oranye Tua) (Oranye) (Kuning Tua)
0,29 0,10 0,13 0,18

Pembahasan Hasil

Percobaan yang dilakukan kali ini yaitu mengekstrak pigmen dari sampel buah tomat dan
analisa TLC-nya. Hal pertama yang dilakukan yaitu menimbang sampel sebanyak 5,08 g dan
menghaluskannya menggunakan mortar. Setelah halus, sampel dilarutkan kedalam 5 mL
aseton untuk diekstrak. Sampel disaring dan diambil filtratnya. Ekstrak sampel buah tomat ini
menghasilkan larutan berwarna oranye transparan.
Kromatografi merupakan metode pemisahan dua komponen atau lebih dalam suatu
campuran homogen berdasarkan distribusi senyawa-senyawa tersebut dalam dua fasa, fasa
diam dan fasa gerak. Fasa diam atau stationary phase adalah bagian yang letaknya tetap atau
diam disepanjang kolom pemisahan, dapat berupa zat padat atau zat cair. Fasa gerak atau
mobile phase adalah bagian yang bergerak sepanjang kolom pemisahan dari ujung sampai
akhir kolom dengan proses kromatografi, dapat berupa zat cair atau gas. Pada percobaan ini,
kita menggunakan kromatografi lapis tipis silika dengan eluen aseton : heksana (3 :7).
Selanjutnya pembuatan kolom kromatografi menggunakan silika 2,03 g yang dilarutkan
dengan aseton. Silika tidak larut dalam aseton. Setelah adonan dibuat, sesegera mungkin
untuk dituang kedalam kolom kromatografi. Saat penuangan usahakan agar campuran tidak
kering (kehabisan pelarut). Hal ini dapat membuat adonan cepat kering sehingga penyebaran
adonan silika tidak merata. Kolom kromatografi berupa alat seperti pipet tetes yang kedua
ujungnya terbuka. Sebelum adonan dituang didalam kolom, ujung dari kolom kromatografi
harus ditutup atau disumbat dengan kapas. Hal ini dilakukan agar saat melakukan
kromatografi kolom, silika tidak ikut turun sehingga nantinya akan mempengaruhi hasil yang
diperoleh. Jumlah kapas jang terlalu banyak, agar penyaringan tidak berlangsung terlalu
lambat. Penuangan adonan silika harus merata karena apabila tidak merata akan
mempengaruhi hasil kolom kromatografi.
Kaidah kelarutan lebih dikenal dengan prinsip like dissolve like. Setiap yang bersifat
polar hanya dapat larut dalam pelarut polar, demikian juga yang setiap yang non polar hanya
akan larut dalam pelarut nonpolar. Untuk yang semi polar tentunya menyesuaikan dengan
ukuran kepolaran yang dimilikinya. Bahan yang ionik tentunya juga lebih larut dalam pelarut
polar. Bahan yang bersifat polar terdiri dari bahan yang bersifat ionik atau kovalen. Untuk
yang non polar umumnya adalah bersifat kovalen. Pada kasus karotenoid, karotenoid bersifat
polar karena dilarutkan oleh senyawa polar juga yaitu aseton.
Setelah kolom kromatografi siap, selanjutnya tuang sampel sedikit demi sedikt kedalam
kolom. Penuangan ini dilakukan sebelum jumlah pelarut aseton habis. Setelah pelarut aseton
tinggal sedikit, tambahkan campuran pelarut aseton : heksana. Sedikit demi sedikit sampel
memisah sesuai dengan warnanya, yaitu kuning, oranye tua, oranye, dan kuning tua. Hal ini
membutuhkan waktu yang lama. Sampel yang menetes dari kolom kromatografi telah
memisah sesuai dengan pigemn yang dikandunganya. Untuk pigmen yang berwarna kuning
(fraksi I) diperkirakan mengandung likopen. Fraksi II berwarna oranye tua mengandung -
karotenoid. Fraksi III berwarna oranye mengandung karoten. Fraksi IV berwarna kuning
tua diperkirakan mengandung xantofil. Hal ini membuktikan bahwa diantara keempat pigmen
tersebut, likopen memiliki berat molekul yang paling kecil, selanjutnya -karotenoid,
karoten dan xantofil.
Setelah semua sampel turun, segera lakukan KLT dengan eluen aseton : heksana (3:7).
Plat KLT diberi batas bawah dulu yaitu 1 cm dari ujung plat bawah. Kemudian dari garis
tersebut diukur jaraknya hingga ujung atas plat KLT. Hal ini sebagai data jarak tempuh eluen
yaitu 3,7 cm. Keempat sampel ditotolkan diatas garis dengan jarak yang jangan terlalu dekat
agar praktikan dapat melihat sampel yang naik. Penetesan cukup 2 tetes dengan urutan sesuai
pigmen yang menetes terlebih dahulu. Warna pigmen tidak berpengaruh dengan warna
ekstrak, karena warna pigmen setelah bertemu dengan silika selalu mengeluarkan warna
pigmen yang dicari, yaitu klorofil, xantofil dan karoten. Faktor yang mempengaruhi daya
serap yaitu sifat komponen, sifat absorben dan temperatur. Sifat komponen yang dimaksud
ialah aseton : heksana (fase gerak), sedangkan sifat absorben nya ialah plat TLC (fase diam),
dan temperatur sebagai suhu ruang.
Dari hasil pengamatan terlihat bahwa titik tebal berwarna kuning pada plat TLC bergerak
naik ke atas. Hal ini karena adanya perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran
tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak. Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran bersama-
sama. Komponen-komponen yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.
Dalam kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap sedangkan fase gerak adalah
pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Semua pigmen warna naik, namun tidak tinggi.
Yang paling tinggi kenaikannya adalah warna kuning (likopen) kemudian disusul pigmen
warna kuning tua (xantofil), -karotenoid, dan karoten. Sampel tidak terlalu tinggi karena
adanya human error,yaitu kurang jenuhnya eluen didalam chamber. Sehingga sampel tidak
terlalu tinggi kenaikannya.

Kesimpulan

Kromatografi adalah proses pemisahan berdasarkan kecepatan migrasi melalui fase diam
yang dibawa oleh fase gerak. Pemisahan sampel ekstrak tomat dilakukan dengan metode
kromatografi TLC, yaitu dengan melarutkan 5 g tomat menggunakan 5 mL pelarut aseton.
Dan menyaring larutan sehingga nantinya akan didapat ekstrak tomat. Ekstrak tomat
dipisahkan pigmennya menggunakan kolom kromatografi. Selanjutnya masing-masing
pigmen yang membawa warna tersendiri akan dipisahkan dengan metode TLC dan pelarut
aseton : heksana = 3 : 7. Nilai Rf yang diperoleh untuk 0,29; 0,10; 0,13; 0,18.

Referensi

Frank, A, H,. RJ. Cogde II. 1995. Carotenoids in Photosintesys, Photochemistry &
Photobiology. Vol. 63 (3). Halaman 257-264.
Gritter, Roy, J,. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : Penerbit ITB.
Gross,J. 1991. Pigmen in Vegetables : Chlorophylls and Carotenoids. New York : Van
Hostrand Reinhold.
Saran
 Disarankan agar sebelum praktikum, praktikan segera menyiapkan kolom pisah sehingga
saat praktikum sedang berlangsung, masalah-masalah yang terjadi dapat segera diatasi.
Diharapkan pula agar praktikan membawa sampel yang lebih bervariasi agar hasil praktikum
dapat saling dibandingkan dan didiskusikan.

Nama Praktikan

Lubabah Putri Dhuha (121810301061)