Paraf Asisten

JURNAL PRAKTIKUM KIMIA ORGANIK

Judul : Ekstraksi dan analisa pigmen daun bayam

Tujuan Percobaan :
1. Mempelajari teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari sampel padatan
2. Mempelajari teknik analisa thin layer chromatography (TLC)

Pendahuluan
Bayam merupakan sayuran yang mudah ditemukan di Indonesia. Sayuran ini memiliki
banyak manfaat bagi tubuh karena mengandung vitamin A, vitamin B1, dan vitamin C,
protein, sumber kalisum, dan zat besi, selain itukadar karetonoid pada bayam tergolong
tinggi. Karotenoid merupakan pigmen yang berwarna kuning, oranye atau merah, sehingga
dapat diidentifikasi melalui warnanya. Karetonoid memiliki dua fungsi yaitu sebagai pigmen
yang membantu dalam fotosintesis (klorofil) yaitu sebagai penyerap energi cahaya matahari
dan sebagai pewarna. Klorofil merupakan elemen yang penting untuk menentukan kandungan
gizi pada bayam. Sayuran bayam ini memiliki ciri-ciri berdaun tunggal, ujungnya meruncing,
lunak, dan lebar, dan berwarna kemerah-merahan.Keunggulan dari bayam merah ini
merupakan sayuran dengan kandungan Vitamin A (betakaroten), vitamin C, dan asam amino
sedangkan kandungan mineral yang terdapat dalam bayam merah yaitu zat besi dan kalsium
(Herdiana et al, 2016).
Pigmen merupakan zat warna alami yang dapat dihasilkan oleh mahluk hidup. Zat
warna alami umumnya kurang stabil dan mudah mengalami perubahan fisik maupun
kimiawi. Stabilitas warna dari zat pewarna dapat dipengaruhi oleh cahaya, pH, oksidator,
reduktor dan surfaktan. Karotenoid merupakan salah satu jenis pigmen berwarna kuning,
orange atau orange kemerahan yang banyak ditemukan pada tumbuhan, kulit, cangkang atau
kerangka luar hewan air. Karotenoid juga dapat ditemukan pada kelompok bakteri, jamur,
ganggang dan tanaman hijau. Karotenoid berperan untuk menyerap energi cahaya yang akan
digunakan dalam proses fotosintesis & melindungi klorofil dari fotodamage (Desiana, 2000).
Karotenoid merupakan pigmen alami yang dapat larut dalam lemak. Karotenoid
termasuk dalam golongan terpenoid. Karotenoid merupakan sejenis lipid, sehingga pigmen
ini bersifat liposoluble (larut dalam lemak) dan dapat larut dalam pelarut non polar.
Karotenoid secara struktural merupakan poliena yang memiliki rantai terkonjugasi linier dari
atom karbon yang berhubungan dengan ikatan rangkap dua dan tunggal. Karotenoid tersusun
atas 8 unit isoprena yang terhubung satu sama lain dengan membentuk geometris, jika
diputus pada bagian tengahnya. Karotenoid dapat dibedakan dalam dua jenis yaitu :
1. Karotenoid yang mengandung molekul oksigen, seperti lutein, zeaxanthin, yang
dikenal dengan xanthophill
2. Karotenoid yang tidak mengandug molekul oksigen, seperti α karoten, β karoten,
likopen (karoten). Karoten hanya mengandung karbon dan hidrogen.
(Armstrong dan Hearst, 1996).

Gambar 1. Struktur α-karoten (sumber: Kiokias, 2015)

Gambar 2. Struktur β-karoten (sumber: Kiokias, 2015)

Gambar 3. Struktur klorofil b (sumber: Kiokias, 2015)

Kromatografi ialah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan aliran diferensial
senyawa atau komponen dalam sampel diantara dua fasa. Kromatografi memiliki dua fasa
yang berperan pada proses berlangsungnya kromatografi yaitu fasa gerak dan fasa diam. Fasa
diam merupakan komponen atau kandungan pada sampel yang ada didalam suatu kolom alat.
Fasa diam biasanya merupakan suatu padatan (solid) atau suatu cairan yang terikat dengan
permukaan suatu padatan. Fasa gerak biasanya dapat berupa eluen pembawa zat yang akan
dilakukan pemisahan. Sampel atau zat nantinya akan dibawa oleh fasa gerak ke dalam fasa
diam. Senyawa yang memiliki interaksi yang kuat dengan fasa diam akan bertahan lama di
dalam kolom dan akan keluar terakhir. Senyawa yang memiliki interaksi lemah dengan fasa
diam akan lebih cepat keluar dari alat (Khopkar,1990).
Kromatografi pengukurannya dapat dilakukan dengan cara kualitatif maupun
kuantitatif. Kromatografi ada beberapa jenis antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi
kolom, dan kromatografi gas. Kromatografi kolom merupakan suatu teknik pemisahan yang
digunakan untuk pemurnian bahan kimia tunggal yang berasal dari dalam campurannya.
Teknik kromatografi kolom biasanya digunakan pada aplikasi persiapan pada skala
mikrogram (mg) hingga kilogram (kg). Kromatografi kolom memiliki beberapa kelebihan
atau keunggulan diantaranya yaitu ekonomis (biaya yang dikeluarkan relatif rendah) dan fasa
diamnya tidak sulit untuk dibuang. Metode yang sering digunakan untuk preparasi kolom
antara lain metode kering dan metode basah. Kromatografi gas merupakan teknik pemisahan
kromatografi yang biasanya digunakan dalam analisis kimia untuk pemisahan serta analisis
senyawa yang volatil tanpa penguraian. Kromatografi dapat digunakan untuk menguji tingkat
kemurnian suatu sampel dan bisa membantu proses identifikasi sampel atau senyawa. Fasa
gerak pada kromatografi gas adalah gas pembawa, berupa gas yang bersifat inert atau gas
yang tidak mudah untuk bereaksi. Fasa diam biasanya berupa lapisan cairan mikroskopik
pada padatan (Munzil, 2008).
Kromatografi lapis tipis merupakan teknik pemisahan kromatografi yang dapat
digunakan untuk pemisahan campuran yang tidak mudah menguap (tidak volatil).
Kromatografi lapis tipis dapat dilakukan pada selembar kaca, plastik, atau aluminium foil
yang nantinya akan dilapisi lapisan tipis bahan yang mudah menyerap (absorben). Bahan
tersebut biasanya adalah silika gel, aluminium oksida, atau selulosa. Kromatografi lapis tipis
dilakukan berdasarkan prinsip kerja adsorbsi. Fasa diamnya merupakan suatu padatan yang
akan diaplikasikan atau diterapkan memiliki bentuk atau wujud datar (planar) pada
permukaan kaca atau aluminium sebagai penyangga. Fasa geraknya berupa cairan seperti
halnya pada kromatografi kertas dan kromatografi kolom (Gitter, 1991).
Kromatografi lapis tipis bisa dilakukan dengan menggunakan pelat yang sudah jadi
atau dapat dibuat sendiri. Cara pembuatannya yaitu menggunakan akuades atau kloroform
atau metanol yang digunakan untuk melarutkan suatu padatan adsorben yang akhirnya akan
menjadi atau diperoleh campuran yang halus seperti bubur bersifat homogen. Lapisan tipis
juga dapat dibuat dengan cara menggunakan metode atau teknik pembentangan menggunakan
suatu alat khusus yang disebut dengan Stahl-Desaga, melakukan penyemprotan dengan suatu
alat semprot, penuangan serta pencelupan yang digunakan untuk membuat pelat makro.
Ukuran pada pelat aluminium dapat dibuat sesuai keinginan, baik itu ukuran kecil, sedang
atau besar. Pelat nantinya akan digunakan untuk tempat pengaplikasian sampel, setelah
pengaplikasian maka suatu pelarut akan dialirkan ke atas melalui pelat berdasarkan gaya
kapilaritasnya (Rubiyanto, 2017).
Kromatografi lapis tipis menggunakan jenis pelarut yang terlebih dahulu diuapkan
dengan cara membiarkan pelat pada sampel sebelum akhirnya dimasukkan ke dalam bejana
pengembang. Pelat lalu dicelupkan ke dalam bejana pengembang agar dapat mengembang.
Fasa gerak yang digunakan bisa terdiri dari satu atau lebih jenis pelarut dan bisa digunakan
jenis pelarut yang berbeda maupun sama. Komponen yang ada pada sampel memiliki
kecepatan yang bervariasi atau berbeda sesaui jenis interaksi adsorbsinya dengan fasa diam.
Kromatografi akan berakhir pada saat fasa gerak sudah mencapai jarak tertentu dari ujung
plat satu ke yang lain. Perbedaan atau perbandingan jarak yang ditempuh senyawa dengan
jarak tempuh fasa gerak disebut dengan Rf (retardation factor) (Gitter, 1991).
Nilai Rf yang diperoleh dapat berbeda-beda, hal ini dipengaruhi oleh ruang dan jenis
sampel, sifat sampel dan ukurannya, laju alir pada pelarut atau fasa gerak, jumlah volume dari
pelarut, keadaan setimbang, keadaan lembab, dan preparasi dari sampel. Nilai Rf yang
bermacam-macam merupakan jumlah yang menunjukkan berapa banyak kandungan atau
komposisi penyusun pada campuran yang menjadi sampel pemisahan kromatografi.
Komposisi penyusun yang ukuran partikelnya kecil maka akan memiliki nilai Rf yang besar
dan partikel yang memiliki ukuran yang besar maka nilai Rf akan kecil. Nilai Rf dapat
dirumuskan dengan :

(Khopkar, 1990).
Faktor yang mempengaruhi nilai Rf diantaranya adalah struktur kimia dari sampel
yang akan dipisahkan. Struktur kimia dari sampel sangat mempengaruhi aktivitas dari
absorben, aktivitas absorben bergantung pada luas, besar atau kecilnya struktur. Faktor kedua
yaitu absorben yang berbeda maka nilai Rf nya juga akan berbeda. Faktor ketiga yaitu tingkat
kemurnian dari pelarut yang digunakan. Pelarut yang akan digunakan harus sangat murni,
karena apabila pelarut tidak murni maka proses pemisahan menjadi tidak sempurna. Faktor
keempat yaitu keadaan fisik dari permukaan absorben (plat). Faktor kelima yaitu suhu,
banyaknya cuplikan dan tingkat kejenuhan uap dari pelarut (Sudjadi, 1986).
Kromatografi lapis tipis proses berlangsungnya dipengaruhi oleh fasa diam yang
diaplikasikan. Fasa diam akan mempengaruhi interaksi antara yang dianalisa dengan dua fasa
kromatografi lapis tipis yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam pada kromatografi lapis
tipis bisa menggunakan jenis padatan yang biasa digunakan pada kromatografi kolom. Jenis
adsorben antara lain silika gel, alumina, selulosa dan lainnya. Plat pada kromatografi lapis
tipis sebelum digunakan pada pemisahan senyawa yang netral harus diaktivasi dengan cara
pemanasan atau memanaskan dalam oven yang memiliki suhu 1000̊ C dengan waktu beberapa
menit. Aktivasi tersebut berfungsi agar air atau kelembaban dapat hilang. Pemisahan pada
senyawa yang memiliki sifat basa, pelarut pada kromatografi harus ditambahkan terlebih
dahulu dengan larutan ammonium hidroksida atau dietil amina. Pemisahan yang bersifat
asam maka pelarut harus ditambah dengan asam asetat atau asam cuka (Gitter, 1991).

Material Safety Data Sheet (MSDS)

1. Akuades (H2O)
Akuades memiliki rumus molekul . Akuades didapatkan memalui proses

penyulingan sehingga tidak mengandung mineral. Akuades berfase cair, tidak berwarna, tidak
berbau, dan tidak berasa. Bahan ini tergolong bahan yang stabil sehingga tidak memerlukan
penyimpanan khusus. Akuades tidak menyebabkan korosi pada mata, kulit, dan tidak
berbahaya apabila terhirup maupun tertelan. Tindakan pertolongan pertama yang perlu
dilakukan apabila terjadi tumpahan kecil maupun besar yaitu, dengan mengepel tumpahan
dengan lap kering yang mudah menyerap (Sciencelab, 2019).
2. Aseton (CH3COCH3)
Aseton merupakan bahan kimia yang berbentuk cair, berbau menyengat dan tidak
berwarna. Senyawa ini memiliki berat molekul 58,08 g/mol, titik didih 56,53 °C dan titik
lebur sebesar -94,9 °C . Aseton dapat larut dalam air dingin, air panas dan kloroform. Bahan
ini dapat menyebabkan iritasi pada saluran pernafasan yang ditandai dengan sulitnya untuk
bernafas. Pertolongan yang harus dilakukan ketika terhirup yaitu membawa korban ke tempat
yang terdapat udara segar (Sciencelab, 2019).
3. Heksana (C6H14)
Heksana merupakan senyawa kimia yang berwujud cair dan tidak berwarna. Senyawa ini
memiliki berat molekul 86,18 g/mol dengan titik didih 69 oC, titik lebur -95oC dan sukar larut
dalam air. Senyawa ini termasuk dalam bahan berbahaya jika kontak kulit, mata, terhirup,
maupun tertelan. Pertolongan pertama yang dapat dilakukan yaitu segera cuci dengan air
mengalir kurang lebih 15 menit dan jika trehirup segera bawa ke tempat terbuka
(Sciencelab, 2019).

Prinsip Kerja
Prinsip kerja yang digunakan adalah menggunakan teknik analisa kromatografi lapis
tipis yaitu teknik pemisahan dengan menggunakan adsorben (fase stasioner) berupa lapisan
tipis seragam dan menggunakan dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak Metode pemisahan
ini didasarkan pada perbedaan kepolaran anatra sampel dengan pelarut yang digunakan.

Alat
Mortar, pestle, batang pengaduk, tabung reaksi, chamber TLC, gelas ukur 5 mL,
penggaris, pipa kapiler dan lampu UV.

Bahan
Aseton, pelarut aseton:heksana (2:3), daun bayam dan lempeng silika.

Prosedur Kerja
Sampel (daun, buah atau umbi) sebanyak 5 gram dipotong kecil-kecil. Sampel digerus
menggunakan mortar dan pestle dengan ditambahkan aseton 5 mL. Larutan ekstrak
didekantasi sambil diperas padatan yang tersisa menggunakan spatula (pada dinding mortar)
hingga ekstrak aseton maksimum yang diperoleh atau digunakan bantuan kertas saring untuk
memeras pasta. Ekstrak dimasukan dalam tabung reaksi (sampel 1). Chamber TLC disiapkan
dan ditempatkan pelarut aseton:heksana (3:7) kira-kira setinggi 0,5 cm. Lempeng silika
ukuran tertentu yang sebelumnya sudah ditotolkan sedikit sampel ekstrak:sampel 1 (± 1 cm
dari batas bawah kertas) ditempatkan pada TLC chamber. Chamber ditutup dan ditunggu
pergerakan pelarut hingga sampai batas atas (±0,5 cm dari atas kertas). Lempeng diambil
dengan menggunakan pinset dan dikeringkan. Pemisahan pigmen yang terjadi diamati
menggunakan sinar UV. Jarak yang ditempuh senyawa dan pelarut diukur. Faktor retensi (Rf)
dihitung untuk masing-masing komponen.

Waktu yang dibutuhkan

Kegiatan Waktu
Persiapan alat 15 menit
Preparasi sampel 30 menit
Ekstraksi sampel 20 menit
Isolasi ekstrak sampel 30 menit
 Penyinaran sinar UV 15 menit
Pengukuran nilai Rf 15 menit
Total waktu 125 menit

Nama Praktikan
Tita Dian Nofita (171810301054)