LAPORAN PRAKTIKUM

BIOMOLEKUL

ISOLASI DNA

Disusun Oleh :
Nama : Tyara Salsabila A.P (171810301004)
Dzulkifli Florenda M (171810301021)
Anisatul Afifah S. (171810301051)
Shavira Nargis Rambe (171810301062)
Rifdiani Rahma Alifia (171810301070)
Kelompok : 2
Kelas :B
Asisten :

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2019
 BAB I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan asam nukleat yang mengandung
materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh
bentuk kehidupan secara seluler, sehingga DNA ini sangat penting dalam
kehidupan manusia. DNA mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu
generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam sel akan membentuk
genom (Suryo, 2004). DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas.
DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon,
sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. DNA mitokondria dan kloroplas hanya dapat
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu (Glick, 2005).
Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA
dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam
isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA
dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA
juga dapat dilakukan melalui sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan suaru teknik
yang dilakukan berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang memiliki
berat molekul besar akan berada pada bawah tabung, sedangkan molekul yang
ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menghasilkan
dua macam fraksi yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Rachmat, 2012). Isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya
kontaminan seperti protein dan RNA, sehingga metode yang digunakan harus
efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies. Metode yang dilakukan tidak
boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA (Surzycki, 2000).
DNA berfungsi sebagai pembawa informasi genetik, berperan dalam
menduplikasi diri dan dalam pewarisan sifat, sebagai ekspresi informasi genetik,
pengarah sintesis RNA pada sebuah proses kimia atau transkripsi, kode untuk
pengaktifan protein dan penonaktifan gen serta untuk membuat protein. Teknik
isolasi DNA ini perlu dilakukan agar DNA yang akan digunakan sebagai
penelitian dalam keadaan yang lebih murni, sehingga dapat menganalisis sifat
atau karakter dari DNA yang diisolasi. Isolasi DNA pada saat ini juga dapat
digunakan dalam beberapa kegiatan biologis, misalnya dalam mengawinkan
tumbuhan untuk menghasilkan spesies yang baru.

1.2. Tujuan
Adapun tujuan dari percobaan ini adalah:
1. Melatih kemampuan mahasiswa untuk mengisolasi DNA plasmid.
2. Memahami dan mengetahui berat molekul DNA plasmid

1.3 Manfaat
Adapun manfaat dari percobaan ini adalah:
1. Mahasiswa dapat melatih kemampuan untuk mengisolasi DNA plasmid.
2. Mahasiswa dapat memahami dan mengetahui DNA plasmid.
 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deoxyribose Nucleid Acid (DNA)

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling
penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung
informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya
(Suryo, 2004). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom.
Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel
organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell dkk, 2004).

Gambar 2.1 Struktur DNA

(Sumber: Campbell dkk, 2004).
DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk.
Organisme prokariot memiliki DNA yang berbentuk sirkular dan terletak dalam
sitoplasma, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA yang berbentuk
linier dan terletak dalam inti sel. DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat
penting bagi tubuh kita, dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama
di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah:
1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup
2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan
molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu
fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri
(Goodenough, 1988).
DNA merupakan suatu materi genetik dimana semua informasi terdapat di
dalamnya. DNA tersusun atas tiga komponen utama yaitu gulapentosa
(dioksirobosa), asam fosfat dan pasangan basa nitrogen (purin dan pirimidin).
DNA pada manusia, hewan atau tumbuhan ditemukan pada inti sel atau di dalam
organ lain seperti mitokondria dan kloroplas. DNA disusun dari nukleotida
dimana antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan
dengan ikatan fosfat. Ikatan fosfat tersebut sangat kuat dan biasanya dikenal
sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat ( PO4-)
pada sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga dinamakan asam nukleat
(Goodenough, 1988).
DNA yang menyusun kromosom dan plasmid pada bakteri diselimuti oleh
suatu dinding sel dan pada virus diselimuti oleh protein teretentu. Organisme
prokariot mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid adalah mulekul DNA
yang bentuknya sirkular dengan ukurannya jauh lebih kecil dibanding dengan
kromosom (Lehninger, 1982). Plasmid dapat memperbanyak diri dengan cara
bereplikasi. Plasmid pada umumnya digunakan dalam rekayasa genetik.
Teknologi DNA rekombinan menggunakan E. Coli sebagai host, sehingga dalam
rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai pembawa gen-gen tertentu
yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen ini selanjutnya akan
mengekspresikan produk tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim
(Stanfield, 1996).
Plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada
sel bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari
molekul DNA utama pada kromosom bakteri. Plasmid mempunyai titik ori (origin
of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA
kromosom. Replikasi tersebut dimulai dari titik ori hingga semua plasmid
tereplikasi. Sel bakteri terdiri dari berbagai macam tipe plasmid. Distribusi
plasmid pada bakteri bersifat sporadis karena ada bakteri yang mengandung
plasmid namun ada juga yang tidak, misalnya pada sel bakteri E.Coli. Bakteri
E.Coli mempunyai plasmid F yang menyebabkan bakteri ini mempunyai sifat
konjugatif tertentu. Plasmid F biasa digunakan sebagai vektor untuk membawa
DNA yang akan disisipkan pada genom sel target. Plasmid juga merupakan alat
yang efisien untuk mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi yang sangat
banyak per selnya (Lehninger, 1982).
DNA dapat mereplikasi diri melalui tiga cara yaitu sebagai berikut
1. Semi konservatif
Semi konservatif yaitu apabila dua pita spiral dari “double helix”
memisahkan diri dan setiap pita tunggal dari 'double helix' parental
membentuk pita pasangan yang baru
2. Konservatif
Konservatif yaitu rantai double helix parentalnya tetap utuh, dan semuanya
dapat mencetak double helix yang baru
3. Dispersif
Dispersif yaitu kedua pita double helix parental terputus-putus membentuk
segmen-segmen. Segmen-segmen DNA parental dan segmen-segmen DNA
yang yang baru saling bersambungan dan membentuk dua double helix baru
(Jack, 1995).
2.2 Fungsi dan Struktur DNA
DNA memiliki fungsi untuk menyimpan semua informasi genetik secara
lengkap yang dibutuhkan, untuk memberikan ciri khas dari struktur semua protein
dan RNA pada setiap spesies organisme. DNA berguna untuk membuat program
untuk menempatkan biosintesis sel dan jaringan secara teratur. DNA juga
digunakan untuk menentukan aktivitas organisme sepanjang siklus hidupnya, dan
untuk menentukan sifat spesifik dari organisme tertentu (Lehninger, 1982).
Tiga struktur DNA meliputi struktur primer, struktur sekunder, dan struktur
tersier. Struktur primer dari DNA disusun oleh monomer-monomer nukleotida.
Nukleotida terbentuk dari satu gula pentosa (2-deoksi-D-ribosa) berbentuk
furanosa, satu basa nitrogen yang meliputi purin atau pirimidin, dan satu molekul
fosfat. Arah rantai DNA dari ujung 5’ bebas menuju gugus hidroksil 3’ bebas
(Kusuma, 2010).
Struktur sekunder dari DNA berupa double helix, dimana dua untai
polinukleotida secara anti paralel yang berpilin ke kanan dan melingkari sumbu.
Nukleotida yang merupakan penyusun DNA terdiri atas tiga gugus molekul yaitu
gula dengan 5 karbon (2-deoksiribosa), basa nitrogen, dan gugus fosfat. Basa
nitrogen penyusun DNA adalah golongan purin dan golongan pirimidin. Basa
purin dibagi menjadi dua yaitu adenin (A) dan guanin (G) (Kusuma, 2010).
Struktur tersier dari DNA paling umum ditemukan pada virus dan
mitokondria. Struktur DNA tersier berbentuk lingkaran. Lingkaran terbentuk
karena dari kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang tidak
berujung. DNA dengan struktur tersier dapat diisolasi dari bakteri, virus, dan
mitokondria yang berbentuk superkoil (Kusuma, 2010).
2.3 Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah suatu cara untuk mempelajari DNA. Isolasi DNA
dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Isolasi DNA juga dapat dilakukan
dengan menggunakan sentrifugasi, dimana metode ini didasarkan pada berat
molekul komponen-komponen yang dipisahkan. Komponen yang memiliki berat
molekul besar akan mengendap dahulu di dasar tabung dan komponen dengan
berat molekul yang kecil akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993).
Teknik isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metode kitchen
preparation. Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya
digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk
menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas
sebagai sumber enzim protease serta garam dapur. Isolasi DNA metode kitchen
preparation menggunakan detergen sebagai alternatif sebagai pengganti EDTA
dan SDS, garam dapur sebagai pengganti NaCl analitik dan jus nanas sebagai
pengganti enzim protease .Penambahan detergen dalam isolasi DNA dapat
menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi
hidrofobik detergen dengan protein dan lemak pada membran membentuk
senyawa “lipid protein-detergen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk
karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga
dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia
(Sambrook et al., 1989).
2.3.1 Isolasi DNA Plasmid
DNA plasmid adalah tempat yang digunakan untuk kloning gen. DNA
plasmid harus dipisahkan dari DNA kromosom sehingga akan mempermudah
untuk mendapatkannya. Ukuran dari DNA plasmid sangat kecil daripada DNA
kromosom. Cara pemisahan DNA plasmid dengan DNA kromosom diperlakukan
berbeda. Membran sel dipecah dengan menambahkan detergen. Proses pemecahan
ini akan membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan
komponen lainnya. Hasil proses lisis kemudian ditambahkan potasium untuk
mengendapkan DNA kromosom dan protein. Endapan DNA, protein, dan
potasium dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung
DNA plasmid, RNA dan protein yang diambil untuk dipisahkan dari DNA
plasmid. RNAse dan protese ditambahkan untuk mendegradasi RNA dan protein.
Proses terakhir adalah menambahkan etanol untuk mengendapkan DNA plasmid
(Cooper, 2000).
Kuantitas dari DNA dicerminkan berdasarkan berat molekul bukan oleh
volume. Kuantitas DNA dapat diketahui dengan cara dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang 256 nm atau 260 nm. Kualitas dari
DNA hasil isolasi berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein.
Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat diubah menjadi
konsentrasi, dimana nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml
(Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Elektroforesis gel agrosa merupakan suatu metode yang prinsipnya
berdasarkan pergerakan dari molekul bermuatan pada media penyangga matriks
stabil, yaitu gel agarosa atau poliakrilamid. Pergerakan molekul tersebut di bawah
pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel agarosa berfungsi untuk memisahkan
fragmen-fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb yang berjalan
secara horizontal. Jenis elektroforesis lainnya yaitu elektroforesis poliakrilamid
yang biasanya digunakan untuk memisahkan DNA yang berukuran 1 pb yang
berjalan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid digunakan untuk
menentukan skuens DNA (Muladno, 2002).
2.4 Sentrifugasi
Metode yang digunakan dalam pemisahan campuran salah satunya adalah
sentrifugasi. Sentrifugasi adalah proses pemisahan partikel yang berdasarkan berat
partikel tersebut terhadap densitas layangnya. Gaya sentrifugal adalah proses yang
terjadi apabila perubahan berat partikel dari keadaan normal pada sekitar 9,8 m/s2
menjadi meningkat seiring dengan kecepatan serta sudut kemiringan perputaran
partikel tersebut terhadap sumbunya. Partikel yang memiliki densitas lebih tinggi
daripada pelarut akan turun (sedimentasi) dan partikel yang lebih ringan akan
mengapung. Fungsi metode sentrifugal dalam pemisahan bioteknologi diantaranya
adalah:
1. Memisahkan partikel atau sel darah dari whole blood untuk memperoleh
plasma atau serum
2. Memisahkan endapan partikel dalam pemeriksaan sedimen urin
3. Mendapatkan elemen seluler berkonsentrasi tinggi dan komponen lainnya dari
cairan biologi ntuk pemeriksaan mikroskopik atau pemeriksaan kimia
4. Memisahkan komponen lipid dan komponen lainyya dari plasma atau serum,
dan memisahkan lipoprotein dari yang lainnya
(Sudiono dkk., 2006).
Sentifugasi dibagi menjadi dua, yaitu :
1. Sentrifugasi diferensial
Pemisahan dicapai terutama didasarkan pada ukuran partikel dalam sentrifugasi
diferensial. Densitas partikel yang berada dalam ukurannya dalam suspensi
akan mengendap dengan partikel lebih besar dan padat. Tingkat sedimentasi ini
dapat ditingkatkan dengan menggunakan gaya sentrifugal. Suspensi sel yang
mengalami serangkaian peningkatan siklus gaya sentrifugal akan menghasilkan
serangkaian sedimentasi. Perbedaan kepadatan partikel atau ukuran dibedakan
 berdasarkan partikel terbesar dan paling padat pengendapan dengan kurang
padat dan partikel yang lebih kecil
2. Sentrifugasi Gradien Densitas
Sentrifugasi gradien densitas adalah metode yang disukai untuk memurnikan
organel subseluler dan makromolekul. Gradien densitas yang dapat dihasilkan
dengan menempatkan lapisan demi lapisan media gradien
(Rosalita, 2012).
Alat yang digunakan untuk sentrifugasi adalah sentrifuge. Sentrifuge terdiri
atas rotor dengan lubang-lubang untuk meletakkan cairan wadah atau tabung yang
berisi cairan dan sebuah motor atau alat lain yang dapat memutar rotor pada
kecepatan yang diinginkan. Bagian lain yang terdapat pada sentrifuge modern saat
ini hanyalah perlengkapan yang dimaksudkan untuk melakukan berbagai fungsi
yang berguna dan mempertahankan kondisi lingkungan saat rotor tersebut bekerja.
Komponen utama pada proses sentrifugasi adalah instrumen sentrifuge, rotor, dan
tabung. Bagian pelengkap dalam sentrifuge umumnya mengikuti aplikasi yang
akan dilakukan pada proses tersebut. Instrumen sentrifuge adalah bagian yang
menjadi alat penggerak proses sentrifugasi karena didalamnya memiliki motor
yang mampu berputar dan memiliki pengaturan kecepatan perputaran. Sentrifuge
laboratorium yang digunakan dalam pemisahan adalah pada skala kecil. Volume
cairan ditangani oleh perangkat yang berada dalam kisaran 1-5000 mL. Bahan
yang akan disentrifugasi didistribusikan dalam jumlah yang sesuai tabung
sentrifuge yang pada gilirannya melekat secara simetris dalam blok berputar
disebut rotor (Enny, 2003).
2.5 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul seluler
berdasarkan ukurannya dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada
suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat
digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,
misalnya DNA yang bermuatan negatif. Molekul yang bermuatan negatif apabila
dilewatkan melalui suatu medium (gel agarosa), kemudian dialiri arus listrik dari
satu kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak
dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung
pada rasio muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA,
maupun protein. Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis
fragmen-fragmen DNA hasil dari pemotongan dengan enzim restriksi
(Yuwono, 2008).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan
secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA
pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik
yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Molekul protein bermigrasi pada
medium padat atau gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah
pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik
isoelektrik bersih dan massa molekul protein
(Jean and Francois G., 2010).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam proses elektroforesis DNA,
yaitu:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda
oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran
besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
(Davis dkk., 1994).
Gel agarosa pada umumnya digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
yang lebih besar (lebih dari 200 bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk
fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua fragmen DNA yang berbeda
ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarosa. Mobilitas atau
pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada
konsentrasi agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari
larutan buffer, dan konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA
bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel agarosa.
Molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari
molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak menuju
elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi
yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih
besar antara band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel
yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen
panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih baik pada
fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).
 BAB III. METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
- Mikropipet
- Tabung eppendorf
- Beaker glass
- Erlenmeyer
- Sentrifuse
- Shaker incubator
- Lemari es
- Gabus
- Termometer
- Water bath
3.1.2 Bahan
- Larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH
8) 100 µL
- Larutan II (NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O steril)200 µL
- Larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)150 µL
- Campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol (25:24:1)
- Es batu
- Etanol absolut
- Etanol 70%
- ddH2O
- Koloni tunggal transforman E.Coli (inokulum)
- Gel agarosa 1,5%
- Buffer TAE
- Larutan Etidium Bromida (EtBr) 250 µg/mL
3.2 Skema Kerja
3.2.1 Isolasi DNA plasmid

Koloni tunggal

- diinokulasi
- diinkubasi 37oC
- disentrifugasi
-

pellet

Disuspensi :
Larutan I, II, III

- dihomogenkan
- diekstraksi

Lapisan atas
- dipekatkan
- dinkubasi
- disentrigugasi

pellet
- dilarutkan dalam ddH2O
- Analisis DNA

Hasil
3.2.2 Elektroforesis Gel Agarosa

Gel Agarosa 0,375 g

-dilarutkan dalam 25 mL
buffer TAE

-didinginkan hingga suhu

sekitar 45oC

Sampel

-dicampur buffer BPB dan sukrosa

-dielektrolisis pada buffer TAE 75 V

-dihentikan saat BPB migrasi 2/3

panjang gel

Gel Agarosa

-direndam dalam EtBr

-direndam buffer TAE

-diamati dengan sinar UV

Hasil elektroforesis
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Isolasi DNA plasmid Pet-endo
Koloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 mL media
LuriaBertani cair yang mengandung 2.5 L kanamisin dan diinkubasi pada shaker
incubator pada suhu 37°C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Kemudian
inokulum disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu
4°C, pellet disuspensi dengan larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 Mm Ph 8,
Na2EDTA 10 mM Ph 8) 100 L dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit.
Ditambahkan 200 L larutan II (NaOH 0.2 N 20 L, SDS 1%, ddH2O steril ) dan
dihomogenkan dengan cara membolak balik tabung eppendorf, larutan diinkubasi
di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 L larutan III (kalium
asetat 5M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), diinkubasi dalam es selama 10
menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000
rpm suhu 4°C, supernatan yang diperoleh dipindah secara perlahan dengan
menggunakan pipet ke dalam tabung eppendorf baru yang steril dan ditambahkan
campuran fenol : kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total,
dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm selama
2 menit. Dihasilkan 3 lapis, fasa paling bawah adalah fasa organikk, fasa tengah
adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah fasa cair, fasa cair dipindah
dengan cara memipet secara hati-hati ke dalam tabung eppendorf baru yang steril,
fasa cair tersebut dipekatkan dengan penambahan etanol absolut dingin 2 kali
volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi lagi
12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicucidenganetanoldingin 70%dan tabung
eppendorf dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan
didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 20 L ddH2O.
3.3.2 Analisis DNA dengan elektroforesis gel agarosa
Gel agarosa 1,5% dibuat dengan melarutkan 0,375 g agarosa dalam 25 ml
buffer TAE (Tris Acetat EDTA)pH 8. Agarosa yang sudah larut didinginkan
sampai kira-kira temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan
dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektrolisis dicampur dengan buffer yang
mengandung bromofenol biru (BPB) 0,25 (b/v) dan sukrosa 40 % (b/v).
Elektrolisis dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 volt. Elektrolisis
dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel.
Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) 250
µg/mL selama 30 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10
menit. Hasil elektroforesis dapat diamati dengan sinar UV.
 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1. DNA Plasmid

No Perlakuan Hasil
Larutan menjadi kental, keruh
1. Penambahan larutan I
dan berwarna putih
2. Didiamkan selama 5 menit Tidak terjadi perubahan
Membentuk larutan tidak
3. Penambahan larutan II
berwarna dan homogen
4. Inkubasi selama 15 menit Terdapat lendir pada larutan
Aroma larutan asam dan larutan
5. Penambahan larutan III
tak berwarna
Larutan membentuk 2 fase
dimana pada bagian atas dan
Inkubasi selama 10 menit dan
6. bawah berupa larutan tidak
disentrifugasi
berwarna dan bagian dinding
berupa lapisan tipis emulsi
Ditambah campuran
7. Membentuk emulsi
fenol;kloroform;isoamil alkohol
Supernatan bagian atas dan ditambah
7. Larutan homogen
etanol dingin
8. Diingkubasi selama 60 menit Terdapat pelet
Pelet larut membentuk larutan
9. Pelet diambil dan ditambah etanol
homogen
Larutan homogen dan terdapat
10. Disentrifugasi
sedikit pelet
11. Pelet diambil dan ditambah ddH2O Tidak terjadi perubahan
4.1.2. Hasil gambar elektroforesis
No. Sampel Gambar
1. DNA plasmid

4.2 Pembahasan
Percobaan yang telah dilakukan ada praktikum ini yaitu isolasi DNA
plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkuler yang berukuran relatif kecil
dan berada pada kromosom bagian luar dalam sel prokariot. Plasmid dalam
rekayasa genetika dapat digunakan sebagai vektor untuk mentransfer gen-gen
tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen ini nantinya yang akan
menghasilkan suatu produk komersial seperti insulin. Isolasi DNA plasmid dapat
dilakukan dengan sentrifugasi dan presipitasi. Proses ini dilakukan dengan cara
memecah dan mengekstraksi jaringan-jaringan hingga membentuk ekstrak sel
yang terdiri dari sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Ekstrak sel kemudian dilakukan
pemurnian (purifikasi) sehingga dihasilkan pellet sel yang mengandung plasmid.
Isolasi DNA bertujuan untuk memperoleh DNA yang murni terbebas dari bahan-
bahan lainnya seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi DNA memiliki
ketelitian yang cukup tinggi sehingga harus dilakukan secara hati-hati. DNA yang
akan diisolasi adalah DNA plasmid untuk kemudian dianalisis dengan
elektroforesis sel agarosa.
Isolasi DNA merupakan dapat digunakan untuk memperoleh gen dari
DNA dari bakteri E. Coli. Isolasi DNAdari bakteri E. coli pada praktikum kali ini
dilakukan dengan menggunakan cara alkalin lisis. Metode alkalin lisis merupakan
suatu metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid yang ada dalam
sel bakteri E. coli. Isolasi tersebut dilakukan melalui proses lisis pada membran
sel dengan menggunakan Sodium Dedosil Sulfat pada suasana basa. Bakteri E.
coli dibiakkan dalam media LB yang sudah ditambahkan kanamisin, kemudian
diinkubasi selama ±16 jam pada 37oC dengan kecepatan 150 rpm, dimana tahap
ini sudah dilakukan oleh asisten sehingga praktikan melanjutkan tahap berikutnya.
Tahap isolasi plasmid berikutnya yaitu diambil 5 ml suspensi sel dan dilakukan
sentrifuse 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 2 menit. Sentrifuse ini bertujuan
untuk memisahkan material selular (DNA) dengan cairan yang terdapat dalam sel
dan juga media LB sehingga semua material penyusun sel berada dalam pellet.
Hasil dari sentrifuse yaitu supernatan dan pellet.
Supernatan merupakan substansi hasil sentrifugasi yang memiliki berat
jenis yang lebih kecil. Pellet adalah adalah substansi hasil sentrifugasi yang
memiliki berat jenis yang lebih besar. Posisi supernatan berada pada lapisan atas
dengan warna yang lebih jernih dan pellet berada pada bagian bawah dengan
warna yang lebih keruh berupa endapan. Sel dari bakteri Escherichia coli akan
berada pada pellet sehingga supernatan harus dipisahkan dan dibuang melalui
proses sentrifugasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah pemisahan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal
sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi
yang lebih ringan akan terletak di atas. Hasil pelletnya diambil dan supernatannya
disimpan.
Tahap pertama yang dilakukan yaitu pellet disuspensi dengan
menggunakan larutan I (campuran dari glukosa 50 mM, Tris-Cl 2.5 mM pH 8,
Na-EDTA 10 mM pH 8 sebanyak 100 mL) sebanyak 100 µL dan dihomogenkan
lalu didiamkan 5 menit. Penambahan ini berfungsi untuk melarutkan pellet.
Pendiaman ini dilakukan dengan tujuan agar reaksi berjalan dengan sempurna,
sehingga pellet benar-benar telah larut. Glukosa dapat berperan sebagai buffer
yang dapat mempertahankan pH. Larutan EDTA dapat menghambat DNAse.
Enzim DNAse merupakan enzim yang dapat mendenaturasi DNA. Larutan EDTA
dalam larutan buffer berperan sebagai agen pengkelat yang digunakan untuk
mengikat ion logam Ca2+ dan Mg2+. Logam ini merupakan kofaktor dari DNAse.
Kofaktor tersebut akan berikatan dengan EDTA membentuk kompleks. Kofaktor
yang berinteraksi dengan EDTA dalam buffer akan mengganggu kerja DNAase.
Keberadaan enzim DNAase sangat merugikan karena akan mengganggu proses
isolasi DNA. Hal tersebut akan memberikan kemungkinan yang sangat kecil
untuk terjadinya degradasi pada DNA yang akan diisolasi pada praktikum kali ini.
Tris-HCl berfungsi untuk menjaga pH larutan. Pellet dilarutkan atau
dihomogenkan dengan cara dikocok kemudian diketuk-ketuk selanjutnya
didiamkan agar reaksi atau proses isolasi dapat berlangsung dengan sempurna.
Pellet yang telah tersuspensi kemudian ditambahkan larutan II (NaOH 0,2
M, SDS 1%, ddH2O steril) sebanyak 200 µL dan dihomogenkan dengan cara
membolak-balik tabung Eppendorf. Penambahan ini dapat digunakan untuk
melisiskan dinding sel. SDS dapat merusak membran sel bakteri. Membran sel
yang akan dilisis yaitu pada bagian fosfolipid (lemak) dan protein. Komponen
penyusun sel akan keluar dari dalam sel ketika membran sel telah mengalami
kerusakan. Penambahan NaOH pada larutan II berfungsi untuk membuat sistem
dalam kondisi basa pada kisaran pH 12,0-12,5. Hal ini dikarenakan dengan
adanya perubahan pH akan menyebabkan proses denaturasi DNA plasmid dalam
sel bakteri E. coli. Ikatan hidrogen yang ada pada DNA plasmid akan terputus
dalam suasan pH tersebut. Hal tersebut akan membuat rantai double helix pada
DNA akan terbuka dan membentuk single helix. Campuran kemudian
dihomogenkan dan diinkubasi selama 15 menit. Inkubasi pada proses tersebut
berfungsi untuk melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan pada
mikroorganisme.
DNA yang mengalami denaturasi harus direnaturasi karena DNA
merupakan produk yang akan diisolasi. Proses renaturasi DNA dilakukan dengan
penambahan larutan III yang terdiri atas kalium asetat, asam asetat glasial, dan
ddH2O dingin lalu diinkubasi dalam es selama 10 menit. Penambahan larutan III
untuk mempertahankan agar pH DNA plasmid tidak rusak. Kondisi larutan yang
awalnya basa kemudian berubah menjadi kondisi netral. Kalium asetat dapat
membantu terjadinya renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA
karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar
garam yang tinggi, kemudian diinkubasi selama 10 menit. Proses renaturasi pada
DNA berlangsung secara sempurna. Hal ini dikarenakan struktur DNA yang
merupakan DNA plasmid adalah sirkular. Proses pemisahan DNA dapat
dilakukan dengan cara sentrifuse. Proses sentrifugasi dilakukan kembali dengan
12.000 rpm setelah penambahan larutan III. Hasil yang diperoleh yaitu larutan
membentuk 2 fase dimana pada bagian atas (supernatan) dan bawah berupa
larutan tidak berwarna (pellet) dan bagian tengah berupa lapisan tipis emulsi.
Pemisahan ini dapat terjadi karena adanya perbedaan berat molekul yang
signifikan diantara keduanya. DNA plasmid berada dalam supernatan dengan
berat molekul yang lebih kecil. Hasil pelletnya disimpan dan supernatannya
diambil. Supernatan yang diperoleh tidak berwarna. Hal tersebut menunjukkan
bahwa telah terjadi pengendapan secara sempurna sehingga tidak mencemari
supernatan. Perlakuan ini dilakukan pada suhu 4°C karena pada suhu ini proses
pemisahan atau proses reaksi berlangsung dengan sempurna.
Supernatan dipindahkan secara perlahan dengan menggunakan pipet
kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol :
kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) sebanyak 1 kali volume total. Penambahan
ini bertujuan untuk menghilangkan protein dan pengotor-pengotor lain dalam
larutan. Pelarut organik akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi protein
sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA. Campuran kemudian
dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit
menghasilkan 2 lapis yang seharusnya 3 lapis. Lapisan fasa paling bawah adalah
fasa organik, fasa tengah adalah suatu emulsi putih dan fasa paling atas adalah
fasa cair. Bagian atas merupakan supernatan, kemudian dipindahkan dengan cara
mempipet secara hati-hati dalam tabung eppendorf baru yang steril, kemudian
dipekatkan dengan menambahkan etanol absolut dingin. Fungsi penambahan
etanol absolut yaitu untuk mengendapkan plasmid karena adanya perbedaan
polaritas. Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada keadaan dingin
dengan tujuan agar banyak DNA plasmid yang mengendap. Prinsip pengendapan
dengan menggunakan etanol absolut dingin, yaitu pada saat penambahan garam
yaitu Na-asetat yang berfungsi sebagai penetral muatan pada gula fosfat DNA,
maka ion-ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan
negatif. Gaya elektrostatik di dalam air antara ion positif (Na+) dan negatif (DNA)
masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Air
memiliki konstanta dielektrik yang tinggi, sehingga penambahan pelarut organik
seperti etanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak
ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi.
Langkah selanjutnya adalah diinkubasi selama 1 jam dan disentrifugasi
kembali menghasilkan pellet dalam jumlah yang sangat sedikit. Supernatan
dibuang dan dilakukan penambahan etanol 70% pada pellet. Fungsi penambahan
etanol adalah untuk menghilangkan pengotor (sisa-sisa larutan yang digunakan
untuk mengendapkan plasmid sebelumnya) sehingga diperoleh plasmid yang
murni. DNA dalam alkohol akan menggumpal sedangkan DNA dalam air akan
larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Proses terakhir yang disebut
dengan tahap presipitasi. Tahap presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein
histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan
dengan protein histon, menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat
terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung. Tabung
eppendorf dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan
didiamkan selama 5 menit, kemudian pellet dilarutkan dalam 30 uL ddH2O.
Keberhasilan isolasi dapat diketahui dengan menggunakan elektroforesis gel
agarosa. Elektroforesis gel agarosa merupakan suatu teknik pemisahan
berdasarkan muatan dan ukuran molekul dengan menggunakan medan listrik
(Suryo, 2004). Proses elektroforesis dibantu dengan adanya kekuatan medan
listrik yang dialirkan pada suatu medium yang berisi sampel DNA. Aliran listrik
yang diberikan pada sel agarosa akan menyebabkan aliran elektron bergerak dari
sisi negatif menuju ke sisi positif. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan
listrik dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu ukuran molekul DNA, konsentrasi
gel, densitas muatan, pori-pori gel, dan tegangan listrik yang diberikan. Gel
agarosa digunakan karena memiliki keuntungan yaitu tekniknya relatif sederhana
dan penanganannya mudah. Gel agarosa mempunyai kemampuan untuk
memisahkan DNA dengan range ukuran 70 pb sampai 800.000 pb. Elektroforesis
dengan gel agarosa dijalankan secara horisontal inilah perbedaannya dengan
elektroforesis poliakrilamid yang dijalankan secara vertikal.
Gel agarosa 1,5% dibuat dengan melarutkan 0,375 g agarosa dalam 25 ml
buffer TAE (Tris Acetat EDTA) pH 8. Fungsi buffer bukan hanya untuk menjaga
pH agar tetap stabil, tetapi juga sebagai sumber ion untuk mendukung
konduktivitas. Gel agarosa dibuat untuk mempermudah molekul fragmen DNA
bergerak karena adanya perbedaan kekuatan ionik. Elektroforesis gel agarosa
berfungsi untuk analisis protein dan fragmen kecil asam nukleat dengan ukuran
sampai 350.000 Dalton (500 bp). Gel agarosa mempunyai pori yang kecil,
sehingga tidak cocok dengan molekul asam nukleat yang berukuran besar atau
molekul DNA utuh. Agarosa yang sudah larut didinginkan sampai kira-kira
temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan
memadat. Tujuannya yaitu agar agarosa memadat dan dapat digunakan sebagai
media untuk melangsungkan elektroanalisis. Gel yang sudah terbentuk
dimasukkan ke alat elektroforesis kemudian ditambahkan running buffer. Running
buffer ditambahkan agar pergerseran gel semakin mudah saat dilakukan
elektroforesis. Sampel yang akan dielektrolisis dicampur dengan buffer yang
mengandung bromofenol biru (BPB) 0,25 (b/v) dan sukrosa 40 % (b/v).
Bromofenol biru ini dapat digunakan sebagai pewarna DNA sehingga dapat
digunakan untuk menentukan pergerakan DNA dalam agarosa. Elektrolisis
dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 volt. Pemberian voltase pada
proses elektroforesis mempengaruhi kecepatan dari pergerakan molekul DNA,
dimana semakin tinggi voltase yang diberikan maka semakin cepat dan mudah
molekul DNA beregarak. Molekul DNA terdapat gugus pospat yang bermuatan
negatif sehingga akan bergerak menuju area yang bermuatan positif. Ukuran DNA
yang kecil akan mudah bergerak sehingga migrasi lebih cepat dibandingkan
dengan DNA berukuran besar.
Proses running elektroforesis dihentikan ketika bromofenol biru bermigrasi
sampai ujung gel. Gel agrosa kemudian direndam dalam EtBr selama 3-5 menit.
EtBr disini berfungsi sebagai pewarna dimana zat ini nanti akan berinteraksi
dengan molekul DNA yang bersifat basa dan akan memunculkan warna orange
flouresance ketika disinari lampu UV. EtBr akan menginterkalasi diantara 2 untai-
untai DNA yang berpendar, sehingga muncul fragmen DNA yang memisah sesuai
ukurannya. Fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan adalah sebagai berikut:

Gambar 4.1. DNA plasmid

Hasil diatas menunjukkan bahwa DNA plasmid tidak teramati pada oleh
sinar UV atau tidak terisolasi. Hal ini disebabkan oleh saat penambahan
fenol:kloroform:isoamil alkohol dan dilanjutkan dengan proses sentrifugasi tidak
terbentuk 3 fase, hanya terbentuk 2 fase. DNA yang terisolasi ditandai dengan
terbentuknya 3 fase.
 BAB V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dalam praktikum isolasi DNA kromosom dan plasmid yaitu,
1. Isolasi DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa
reagen larutan. Larutan ini dapat digunakan untuk merusak (lisis) sel. DNA
yang telah diisolasi kemudian diuji dengan menggunakan teknik
elektroforesis dimana akan menghasilkan DNA plasmid yang memiliki 2
pita.
2. DNA plasmid memiliki bentuk yang berbeda dan berat molekul yang
berbeda cukup siginifikan. DNA palsmid memiliki struktur tersier yang
kaku. DNA ini dapat dipisahkan dari proses renaturasi dan sentrifugasi.

5.2 Saran
Saran untuk praktikum isolasi DNA plasmid adalah praktikan harus lebih
disiplin selama melakukan percobaan di laboratorium. Praktikan harus mengusai
materi dan prosedur kerja dengan baik untuk mendapatkan hasil praktikum yang
sesuai dan baik serta dapat meminimalisir terjadinya keasalah. Praktikan harus
menggunakan lab safety use dan memperatikan SOP untuk menghindari
kesalahan dan kecelakaan kerja serta untuk mendapatkan data yang benar.
 DAFTAR PUSTAKA

Campbell, Jane B. Reece & Lawrence G. Mitchell. 2004. Biology- 10th I'd.
USA: Pearson Eduaction Inc.
Cooper. 2000. The Tools of Biochemistry. USA: John Wiley and Sons.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Norwola: Appleton & Lange.
Enny, Riadi W. 2003. Nilai Rujukan Sedimen Urin Secara Kuantitatif
Menggunakan Shih-Hyung Bagian Patologi Klinik Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia Rsupncm. Jakarta: Universitas Indonesia.
Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 2005. Molekuler Biotechnology, Principles and
applications of Recombinan DNA. Washinton D.C : ASM Press.
Goodenough.1988. Understanding DNA. Amsterdam: Academic Press.
Jack, R.C. 1995. Basic Biochemical Laboratory and Computing. New York:
Oxford University Press.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Kusuma, S.R.F. 2010. PCR. Makalah Fak. Farmasi. Bandung: Universitas
Padjadjaran.
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA
fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine
27(2): 351-354
Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Edisi Pertama. Jakarta: Erlangga.
Mader, S. S. 1993. Biologi. Lowa : WM. C Brown Publisher.
Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.
Rosalita, L. 2012. Pengaruh Penundaan Waktu Terhadap Hasil Urinalisis
Departemen Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Islam
Indonesia. Yogyakarta: Universitas Islam Indonesia.
Sambrook J., E. F. Fritcs and Manicitis, T. 1989. Molecular Kloning
A Laboratory Manual. 2nd Edition. USA: Harbor Laboratory Press.
Standfield W.D., Jaime S.C., Raul J.C. 2006. Molecular and Cell Biology.
 New York: Oxford University Press.
Sudiono H, dkk. 2006. Urinalisis. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas
Kristen Krida Wacana.
Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Teknik Pengklonan Gen. Bogor: Institut
Pertanian Bogor.
Suryo, 2004. Genetika Manusia. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.
Surzycki, S.J. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag
Publisher ISBN 3-540-66678-8.
Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.