KROMATOGRAFI PERMIASI GEL

Gel permeation chromatography

Indah Solihah, M.Sc., Apt
 Tujuan Perkuliahan
• Mahasiswa mampu menjelaskan metode kromatografi
permeasi gel
• Mahasiswa mampu memilih fase gerak dan fase diam untuk
kromatografi permeasi gel
• Mahasiswa mampu menjelaskan kekurangan dan kelebihan
dari metode kromatografi permease gel
• Mahasiswa mampu melakukan penerapan aplikasi
kromatografi permeasi gel
 Sejarah
• 1905 : W.Ramsey memisahkan campuran
gas dan uap dari suatu adsorben padat
seperti batu bara
• 1908 : Mikhail Tswett, seorang botanist
dari Rusia, memisahkan pigmen tanaman
dg teknik yg disebut kromatografi karena
hasil analisanya ‘tertulis’ dalam bentuk
warna sepanjang kolom pengadsorbsi
• Kromatografi berasal dari kata :
– Chroma berarti warna
– Graphein berarti menulis
 Pengertian dan Prinsip Kromatografi
• Kromatografi adl teknik pemisahan fisik suatu
campuran senyawa-senyawa kimia berdasarkan
perbedaan migrasi dari masing-masing komponen
campuran yg terpisah pada fase diam di bawah
pengaruh pergerakan fase gerak

Works by allowing the molecules present in the mixture to distribute

themselves between a stationary and a mobile medium
Molecules that spend most of their time in the mobile phase are carried
along faster
 Klasifikasi Kromatografi
• Kromatografi dapat dibedakan berdasarkan:
1. Fase gerak
2. Kemasan fase diam
 Klasifikasi kromatografi
• Berdasarkan fase geraknya, kromatografi
dapat dibagi menjadi:
– 1. Kromatografi Cair
• Fase gerak : cairan (liquid)
• Misal : LC, HPLC
– 2. Kromatografi Gas
• Fase gerak : gas
• Misal : GC
 Klasifikasi Kromatografi
• Berdasarkan kemasan fase diamnya,
kromatografi dapat dibedakan menjadi :
– 1. Kromatografi lapis tipis
– 2. Kromatografi kertas
– 3. Kromatografi kolom
High Performance Liquid Chromatography

• HPLC merupakan pengembangan kromatografi kolom

• Digunakan secara luas untuk pemisahan suatu
campuran
• Prinsip pemisahan tergantung jenis kolom yg
digunakan
Prinsip pemisahan
• KPG bekerja berdasarkan perbedaan ukuran
komponen atau BM komponen dalam cuplikan
• Analit yg lebih kecil akan memasuki pori lebih
mudah, waktu retensinya akan lebih lama.
Sebaliknya, analit yg lebih besar sedikit memasuki
pori sehingga lebih cepat terelusi.
• Sistem kromatografi dapat dilakukan manual atau
otomatis dengan HPLC

Skema pori vs analit

• KPG digunakan dalam salah satu hal berikut:
1. Senyawa dengan BM tinggi terutama yang
tak terionkan
2. Campuran yang terdiri dari komponen yg
sangat berbeda berat molekulnya
3. Pemisahan awal, eksplorasi cuplikan yang tak
diketahui
Fasa Diam
Fasa diam yang digunakan untuk KPG dibedakan menjadi:
- Semi rigid : Styragel, Poragel, TSK gel
Keuntungan : dapat memisahkan sampel polimer yang rumit,
Kelemahan : waktu analisis lebih panjang, pembuatan kolom
agak rumit
- Lunak : Spharose, Sphadex
Mudah menggembung dalam air.
Keuntungan : dapat memisahkan polimer dengan rentang
bobot yang lebar 102-2,5.107 dalton.
Kelemahan : sangat rapuh dan tidak dapat menahan tekanan
tinggi
Fasa Gerak
- Fasa gerak harus melarutkan sampel dg baik
sehingga dapat direspon oleh detektor,
viskositas rendah, serta dapat membasahi
permukaan kolom.
- Eluen yg umum digunakan untuk polimer yg
larut pada suhu ruang adalah tetrahydrofuran
(THF); o-dichlorobenzene dan
trichlorobenzene pada130–150 °C untuk
kristalin polyalkynes; dan m-cresol & o-
chlorophenol pada 90 °C untuk polimer
terkondensasi seperti polyamides dan
polyesters.
• Ada batas range ukuran molekul yg dapat
dipisahkan pada kolom tertentu, karena itu
ukuran pori kemasan harus dipilih sesuai
dengan range BM analit yg dipisahkan.
• Misalkan biogel 0 – 10 digunakan untuk zat-
zat dengan berat molekul berkisar antara 500-
17000
• Detektor
• Konsentrasi polimer atau cuplikan dalam larutan pengelusi
dapat dimonitor secara kontinu dengan detektor,
• Ada beberapa detektor yg dapat digunakan dan dapat
dikelompokan menjadi dua kategori.
– Pertama detektor yang sensitif terhadap konsentrasi, misal: UV,
refraktometer, IR dan detektor densitas.
– Kedua, detektor sensitif terhadap berat molekul, misal : spektrometer
massa
• Kromatogram yang dihasilkan menggambarkan distribusi
berat molekul dari cuplikan sebagai fungsi dari volume retensi
• Detektor yg paling sensitif adl UV dan yg paling umum
digunakan adalah differential refractometer (DRI).
• Variabel Pemisahan lain
• Suhu, KPG umumnya dioperasikan pada suhu kamar,
tapi suhu dapat dinaikkan untuk mengurangi
kekentalan FG atau melarutkan cuplikan yg sukar
larut
• Untuk cuplikan yg cukup stabil, filtrasi gel dapat
dilakukan pada suhu 60oC
A
Molekul yg lebih besar dari tiitik A
tereksklusi total dari semua pori gel
sehingga terelusi sebagai Vo .

Sedangkan analit yg tertahan

sempurna terelusi dengan volume
solvent.

Vi (permiasi selektif), akan muncul

sebagai (pita A dan B).

Senyawa2, yang lebih kecil dari Vi

masuk sempurna kedalam pori partikel
sehingga terelusi sebagai pita dengan
volume retensi Vt.

Volume intrapartikel
Vi = Vt-Vo
Keuntungan penggunaan KPG
1.Pita-pita sempit
2. waktu pemisahan pendek
3. waktu pemisahan mudah diramalkan
4. harga Tr (time retention) sesuai dengan ukuran molekul
5. tidak terjadi kehilangan cuplikan atau reaksi selama
pemisahan

Kekurangan KPG
1. Kapasitas puncak terbatas
2. Tidak dapat digunakan untk cuplikan yang mempunyai
ukuran hampir sama
3. Prinsip pemisahan tidak seperti metoda kromatografi lain
 Komponen instrumen HPLC :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak = Pompa
3. Alat utk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Suatu komputer atau integrator atau perekam
Column: Superdex 200 Increase 5/150 GL.Sample: Carbonic anhydrase (Mr
29000),Thyroglobulin (Mr 669000), Conalbumin (Mr75000), Ribonuclease A
(Mr 13 700), Aldolase (Mr158000). Sample volume: 50 µl and 4 µl. Buffer:10
mM phosphate buffer, 140 mM sodium chloride, pH 7.4. Flow rate:0.45 ml/min,
room temperature

Pertanyaan: jenis kromatografi apa yg digunakan, berikan alasan! Sampel

volume brp yg memberikan pemisahan terbaik, berikan alasannya! Dan
ramalkan masing-masing puncak pada kromatogram tsb!