KROMATOGRAFI

EKSKLUSI

Disusun Oleh : Kelompok 4

Ayu Caesaria
Egitaria Widianti Gulo
Hanny Puji Utami
Tessi Silviavitari
 “Kromatografi Eksklusi”

Merupakan metode kromatografi yang menggunakan partikel

berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang
berbeda.

Pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe & Colin R

Ruthven.

Teknik ini didasarkan pada ukuran partikel dari sampel.

*Molekul besar pada sampel akan dipisahkan dengan molekul yang kecil dalam
sampel
“Prinsip Dasar Kromatografi Eksklusi"
Size-Exclusion Chromatography (SEC) disebut juga Gel Permeation Chromatography (GPC)

Berdasarkan perbedaan ukuran partikel antara solut dengan fase

diam. Solut dengan ukuran kecil akan masuk ke dalam pori-pori
adsorben sehingga tertahan, sedangkan solut dengan ukuran lebih
besar dari pori-pori adsorben akan terelusi lebih dulu.
 “Kategori Kromatografi
Eksklusi"

Teknik Permeasi Gel Suatu teknik yang menguraikan campuran

atau Filtrasi Gel zat-zat sesuai dengan ukuran molekulnya

Suatu proses untuk memisahkan materi ionik

Eksklusi & Reterdasi dari materi non–ionik didasari pada perbedaan
Ion distribusi pada ke dua tipe zat pelarut ini di
antara fase resin penukar ion dan larutan air

Suatu saringan molekul untuk pemisahan

Molekular Sieve Anorgani gas-gas & molekul organik berukuran kecil
c
 “Instrumen Kromatografi Size Eksklusi”

Instrumen kromatografi size eksklusi yang

terdiri dari sebuah pompa untuk mendorong
pelarut melalui instrumen, port injeksi
dilakukakan untuk memasukkan sampel ke
kolom, dan kolom berfungsi untuk menahan
fase diam, sedangkan detektor berfungsi untuk
mendeteksi komponen ketika sampel
meninggalkan kolom, kemudian software akan
berfungsi untuk mengontrol bagian-bagian
yang berbeda dari instrumen dan menghitung
dan menampilkan hasil
 “Fase Diam dan Fase Gerak"
 Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer
yang berpori, sehingga solut dapat melewati pori (lewat
diantara partikel), atau berdifusi melalui fase diam. Contoh
fase diam : dextran, polyacrylamide (bio-gel), dan agarose
Fase diam yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut:
a. Packing material tidak berinteraksi dengan sampel
b. Fase diam harus terbasahi semua dengan fase gerak
c. Fase diam harus stabil pada temperatur yang diatur
d. Harus memiliki volume pori yang cukup & memiliki berbagai ukuran pori
sehingga dapat melakukan distribusi berat molekul sampel yang memadai.
 “Fase Diam dan Fase Gerak"
 Fase gerak pada kromatografi ini tidak berpengaruh,
sehingga pelarut yang berlainan yang mempunyai
daya mensolvasi yang sama menghasilkan hasil yang
sama. Contoh fase gerak : kloroform, m-kresol,
dekalin, dimetil formamida, heksafluoroisopropanol,
tetrahidrofuran, toluene, dan trifluoroetanol.

Fase gerak yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:

a. Harus mampu melarutkan sampel polimer pada fase diam
b. Memiliki viskositas yang cukup rendah untuk sistem kromatgrafi size
eksklusi sehingga dapat dijalankan dengan range tekanan yang normal
c. Harus efektif untuk mencegah molekul polimer dari interaksi yang
kuat dengan fase diam (contoh: lewat adsorpsi).
 “MEKANISME
"

Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalam jaringan dan ditahan dalam fase gerak
yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar,
tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan.
Akibatnya, molekul yang lebih besar terelusi dari kolom molekul cepat dan lebih
kecil kemudian, yang secara efektif macam molekul berdasarkan ukuran. Ini
adalah prinsip pemisahan kromatografi eksklusi ukuran.
Gambar Kolom Kromatografi Eksklusi Ukuran
 Instrumen Kromatografi Ekslusi
1. Pompa
untuk mendorong pelarut melalui instrumen
2. Port Injeksi
untuk memasukkan sampel ke kolom
3. Fase Gerak
Fase gerak dalam kromatgrafi size eksklusi harus merupakan pelarut polimer yang baik untuk
menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai dan bertahan cukup
lama sebelum akhirnya disuntikkan.
4. Software
untuk mengontrol bagian-bagian yang berbeda dari instrumen ,menghitung dan menampilkan hasil.
5. Detektor
Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem detektor yang berbeda-
beda (Ex : refraktometer atau detektor UV-Vis). Intensitas detektor direkam sebagai fungsi volume
pelarut eluen. Sistem dikalibrasi dengan menggunakan polimer sampel yang diketahui berat
molekulnya, dapat dilakukan dengan evaluasi berat molekul dan distribusi berat molekul
menggunakan detektor sinar menyebar (light scatter detector), berat molekul polimer dapat
ditentukan kromatografi size eksklusi langsung dan
tidak perlu dikaliberasi terlebih dahulu.
6. Kolom
untuk menahan fase diam.
Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul zat yang akan dipisahkan. Sampel
yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak mampu dipisahkan jika digunakan satu
ukuran pori-pori dari kolom. Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu
kurva kalibrasi tertentu.
 ANALISIS KUANTITATIF
Parameter-parameter kolom dapat dihubungkan secara matematik
dengan:
Vb = Vo + Vi + Vr = Vo Vs
Vi = m Sr/ Ps
Vi =Vo + Kd Vi
Dimana :
– Vi = volume bagian dalam gel,
– Vr= volume matriks gel,
– Vs= volume total face diam gel,
– m = berat gel,
– Sr = volume pelarut yang dipakai,
– Ps = kerapatan pelarut,
– Kd = koefisien distribusi,
– Pr = kerapatan gel,
– Vb= volume bed,
– Vo= volume di luar gel,
Karena ukuran molekul sangat beragam (berat molekul berbeda-beda)
maka pemilihan ukuran pori kemasan pada umumnya bergantung pada
molekul solut yang akan dipisahkan. Beberapa mungkin dieksklusi
seluruhnya dari pori (K=0) dan terelusi sebagai satu puncak dengan
volume mati (V0), sedangkan yang lain berpermeasi ke semua pori
(K=1) dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum permeasi total (V0
+ Vp). Sedangkan molekul yang lainnya lagi berpermeasi ke pori secara
selektif, bergantung pada ukuran relative dan terelusi dengan volum
retensi (VR) yang dinyatakan oleh persamaan : VR = V0 + KVp
 Kelebihan & Kekurangan Kromatografi
Eksklusi

Kelebihan Kekurangan
• Waktu pemisahan yang
cepat dan hasil yang baik
• Hanya sejumlah frekuensi
• Frekuensi tajam dan
terbatas dapat diakomodasi
sensitivitas baik karena skala waktu
• Bebas dari kehilangan kromatogram pendek
sampel, pelarut tindak • Tidak dapat digunakan
berinteraksi dengan fase untuk sampel dengan
stasioner ukuran seragam, seperti
• Variasi larutan dapat isomer
diaplikasikan tampa
mengganggu proses filtrasi
 Aplikasi Kromatografi Eksklusi

Aplikasi analitik kromatografi eksklusi meliputi :

 Estimasi berat molekul serta analisis campuran molekul dengan BM yang berbeda

 untuk mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis.

 untuk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi

Ex :

Pemisahan/clean up platelets (fungsi penting dalam haemostasis) dari plasma

darah
Metode

Preparative size-exclusion chromatography (kromatografi eksklusi), kolom

kromatografi berukuran 350 x 16 mm dengan Sepharose 4B sebagai fase gerak dan larutan
CDP/Hepharine/Dipyhidamol sebagai eluen, dan sebelumnya di set secara terpisah
eritrosit dan leukosit dengan sentrifugasi.
Fraksi yang diambil adalah 17-19 ml, platelets diendapkan dengan sentrifugasi pada
6000 rpm selama 5 menit. Cairan yang di bagian atas dibuang dan platelets disuspensi
dalam tempat yang baik dan cocok untuk investigasi kimia. Dan light-scattering
digunakan sebagai detektor.
 Daftar Pustaka
• Hendayana, sumar. 2006. kimia pemisahan : PT. Remaja rosdakarya offset
• Khopkar, S.M. 2008. konsep dasar kimia analitik. Jakarta: UI-Press
• Soebagio,dkk. 2004. kimia analitik II. Malang : UNM
• Basha, N.S., Rekha, R., Komala, M., dan Ruby, S., 2009, Production of Extracellular Antileukaemic
Enzyme L-asparaginase from Marine Actinomycetes by Solid- state and Submerged Fermentation:
Purification and Characterisation, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8 (4), 358
• Chaplin, M.F., Bucke C., 1990, Enzyme Technology, 85-86, Cambridge Univ. Pr., NewYork
• Devlin, Thomas M., 1993, Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, edisi ke-3, 358, A John Wiley
and Sons Inc., New York
• El-Sayed, El-Sayed, M., El-Sayed, S.T., Wafaa, Shousa, G., Shehata A.N., dan Hanafy, S.S., 2011,
Purification, Characterization and
• Antitumor Activity of L-asparaginase from Chicken Liver, Journal of American Science, 7 (1), 442
• Handler, P., Hill, R.L., 1978, Principles of Biochemistry, edisi ke-6, 729-730, McGraw- Hill Kogakusha, LTD.,
New York
• Koneenä,P., Klejdus, B., Hrstkovil, H., 2004, Monitoring The Asparaginase Activity and Asparagine Levels in
Children with Acute Lymphoblastic Leukaemia Treated with Different Asparaginase Preparations, Scripta
Medica (BRNO), 77 (2), 55
• Lehninger, A.L., 1982, Dasar-Dasar Biokimia, Jilid 1, 248-249, Penerbit Erlangga, Jakarta Scopes, R.K.,
1987, Protein Purification, Principles, and Practice, edisi ke-2, 51-58, 87, Springer Verlag, New York
• Warangkar, S.C., dan Khobragade, C.N., 2009, Purification, Characterization, and Effect of Thiol
Compounds on Activity of the Erwinia carotovora L-Asparaginase, Enzyme Research, 4