High Performance Liquid

Chromatography (HPLC)
Indah Solihah
 Sejarah
• 1905 : W.Ramsey memisahkan campuran
gas dan uap dari suatu adsorben padat
seperti batu bara
• 1908 : Mikhail Tswett, seorang botanist
dari Rusia, memisahkan pigmen tanaman
dg teknik yg disebut kromatografi karena
hasil analisanya ‘tertulis’ dalam bentuk
warna sepanjang kolom pengadsorbsi
• Kromatografi berasal dari kata :
– Chroma berarti warna
– Graphein berarti menulis
 Pengertian dan Prinsip Kromatografi
• Kromatografi adl teknik pemisahan fisik suatu
campuran senyawa-senyawa kimia berdasarkan
perbedaan migrasi dari masing-masing komponen
campuran yg terpisah pada fase diam di bawah
pengaruh pergerakan fase gerak

Works by allowing the molecules present in the mixture to distribute themselves

between a stationary and a mobile medium
Molecules that spend most of their time in the mobile phase are carried along
faster
 Klasifikasi Kromatografi
• Kromatografi dapat dibedakan berdasarkan:
1. Fase gerak
2. Kemasan fase diam
 Klasifikasi kromatografi
• Berdasarkan fase geraknya, kromatografi
dapat dibagi menjadi:
– 1. Kromatografi Cair
• Fase gerak : cairan (liquid)
• Misal : LC, HPLC
– 2. Kromatografi Gas
• Fase gerak : gas
• Misal : GC
 Klasifikasi Kromatografi
• Berdasarkan kemasan fase diamnya,
kromatografi dapat dibedakan menjadi :
– 1. Kromatografi lapis tipis
– 2. Kromatografi kertas
– 3. Kromatografi kolom
High Performance Liquid Chromatography

• HPLC merupakan pengembangan kromatografi

kolom
• Digunakan secara luas untuk pemisahan suatu
campuran
• Prinsip pemisahan sama dengan KLT
 HPLC
❖ Merupakan teknik pemisahan senyawa
dengan cara melewatkan senyawa melalui
fase diam (stationary phase)

❖ Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi

dengan fase gerak (mobile phase)

❖ Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom

atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga
akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-
wa dengan fase diam dan fase gerak
 HPLC
❖ Senyawa yang keluar dari kolom akan
dideteksi dengan detektor yang sesuai dan
dilaporkan sebagai kromatogram

❖ Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu

retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

❖ Untuk:
- analisis kualitatif digunakan informasi tR,
- analisis kuantitatif digunakan informasi luas
area/tinggi puncak kromatogram
Kualitatif vs Kuantitatif
 Kegunaan HPLC :
• Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik,
maupun seny.biologis
• Analisis ketidakmurnian (impurities)
• Analisis senyawa tdk mudah menguap (non volatile)
• Penentuan molekul2 netral, ionik, maupun zwitter
ion
• Isolasi dan pemurnian senyawa
• Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir sama
• Pemisahan seny2 dlm jml sekelumit (trace
elements)
• Menetapkan kadar seny2 tertentu
 Kelebihan HPLC
• HPLC dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan senyawa
berbobot molekul tinggi.
• HPLC dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian
besar non volatile.
• HPLC biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman
bagi senyawa yg tidak tahan panas
• Pada HPLC kemungkinan antaraksi antara fase gerak dan
analit besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen dan
reaksi ion) → proses pemisahan lebih optimal
• Fase gerak pada HPLC dapat diubah dengan mencampur
pelarut dalam berbagai gradient
• Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa
sekaligus (secara simultan)
 Keterbatasan HPLC
• Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali
jika HPLC dihubungkan dg spektrometer
massa
• Jika sampel yang digunakan sangat kompleks,
maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit
diperoleh
Tujuan Akhir HPLC

HPLC

Pemisahan
 Resolusi
• Tingkat pemisahan komponen dalam suatu
campuran dengan metode kromatografi
direfleksikan dalam kromatogram yang
dihasilkan
• Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-
puncak dalam kromatogram harus terpisah
secara sempurna dari puncak lainnya dengan
sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak
tumpang tindih
Resolusi
Ukuran Daya Pisah
Resolusi
Instrumentasi HPLC
 Komponen instrumen HPLC :
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak = Pompa
3. Alat utk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Suatu komputer atau integrator atau perekam
 Wadah Fase gerak
• Wadah fase gerak harus bersih dan lembam
(inert).
• Contoh wadah fase gerak yg biasa digunakan
mis.wadah pelarut kosong atau labu
laboratorium dg kapasitas 1-2L
 Fase gerak
• Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang
secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.
• Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen
sampel.
• Jenis HPLC dibedakan menjadi fase normal dan fase terbalik
• Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut.
• Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada
fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.
 Normal-Phase HPLC
[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

▪ Senyawa polar:
- terelusi belakangan (tR panjang)
- semakin non-polar fase gerak,
tR senyawa polar makin panjang

▪ Solven:
- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

▪ Eluent strength:
- dimodifikasi dengan n-heksan
25 HPLC-2011
 Reversed-Phase HPLC
Reversed-Phase HPLC
[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]

▪ Senyawa polar:
- terelusi lebih dahulu
▪ Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar
lebih kuat tertahan
▪ Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-
hidrofuran
▪ Eluent strength:
- dimodifikasi dengan air
(Kellner dkk., 1998)

26 HPLC-2011
 Kriteria pemilihan fase gerak
• Viskositas rendah
• Transparansi terhadap UV; jika detektor UV yg
digunakan
• Perbedaan indeks bias antara fase gerak dg
sampel harus besar; jika digunakan detektor
indeks bias
• Titik didih rendah
• Kemurnian tinggi
• Inert
• Tidak toksis
• Harga
 Pelarut UV cut off (nm)
n-heksana 195

Sikloheksana 200
Tetraklorometan 265

Metilbenzen 285
Semakin Polar

Triklorometan 245

Diklorometan 230

Tetrahidrofuran 212

Propanon 330

Asetonitril 190
Iso-propanol 205

Etanol 205
Metanol 205

Asam etanoat 255

Air 170
• Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril.
• Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak
yang paling sering digunakan adalah campuran
pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorinasi atau menggunakan pelarut-pelarut
jenis alkohol, dietileter, atau kloroform.
• Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum
dibanding dengan fase terbalik.
• Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi)
 Catatan
• Fase gerak sebelum digunakan harus
dilakukan degassing (penghilangan gas)
• Pelarut yg digunakan harus dg kemurnian
tinggi (HPLC grade)
 Pompa
• Syarat Pompa HPLC: inert terhadap fase gerak.
• Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat,
teflon, dan batu nilam.
• Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif,
20 mL/menit.
• Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses
penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,
reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan.
• Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan.
• Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini
lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan
tekanan konstan.
 Alat untuk memasukkan sampel
• Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan
secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom
menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample
loop) internal atau eksternal.
Rheodyne Loop Injector
 Kolom
• Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional
dan kolom mikrobor.
• Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama
dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau
lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena
pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih
lambat (10 -100 μl/menit).
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat
kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan
spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut
lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat
bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel
klinis.
Parameter Kolom Konvensional Kolom Mikrobor

Stanless steel Stanless steel

P = 3,10,15,20, dan 25 cm P = 25 dan 50 cm
Tabung Kolom
o.d = 0,25 inci o.d = 0,25 inci
i.d = 4,6mm i.d = 1 atau 2 mm

Tek. Operasional 500-3000 psi (35-215 bar) 1000-5000 psi (70-350 bar)

NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi
atau alkohol .
NP : hidrokarbon+pelarut2
RP : metanol atau asetonitril + air atau
terklorinasi atau alkohol .
buffer
Fase Gerak RP : metanol atau asetonitril +
Kec.Alir : 10-100µL/menit
air atau buffer
Modifikasi Instrumen :
Kec.Alir : 1-3mL/menit
Aliran < 10µL/menit. Katup injeksi sampel
dan sel detektor bervolume kecil

Efisiensi meningkat dg
Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi
berkurangnya uk.partikel fase
lambat.
Kinerja diam, akan tetapi umur kolom
Konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom
dg ukuran partikel 3µm lbh
konvensional
pendek
• Dalam prakteknya, kolom mikrobor tidak
setahan kolom kovensional dan kurang
bermanfaat untuk analisis rutin
 Bagaimana memilih kolom???
❖Untuk memilih kolom (fase diam),
perhatikan beberapa sifat senyawa seperti:
- kelarutan
- kepolaran

❖Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut,

kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut
ini
Kolom Fase Diam HPLC
Particle Size
Beda Ukuran Partikel
 Kolom
• Performance kolom menurun seiring
dengan lamanya waktu penggunaan,
yang ditandai dengan peningkatan
“backpressure” dan lebar puncak
kromatogram
 Pengoperasian Kolom
❖ Untuk kolom “Reversed-Phase” [C8, C18, fenil,
dll], gunakan petunjuk berikut:
- simpan kolom dalam asetonitril atau metanol
atau campuran air dan pelarut organik

- jangan mengoperasikan kolom melebihi pH

yang diperbolehkan (untuk kolom berbasis
silika, disarankan pH 2,5 – 8).
pH > 8 → silika terlarut
pH < 2 → bonded silika terhidrolisis
 Pengoperasian Kolom
❖Selalu flush (aliri) kolom dengan pelarut
kuat (strong solvent) seperti metanol
sebelum digunakan untuk mengeliminasi
setiap analit yang tertahan kuat

❖Jangan pernah biarkan komponen bufer

tertinggal dalam pompa atau kolom,
karena komponen bufer dapat
mengendap dan menimbulkan kerusakan
 Pencucian Kolom
❖ Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.
- Untuk kolom Reversed-phase:
gunakan campuran 96% diklorometan dan 4%
metanol dengan 0,1% amonium hidroksida

- Untuk kolom Normal-phase:

gunakan metanol
Pada keadaan yang sulit:
- lakukan “back-flushing” kolom dengan kece-
patan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]
Perkirakan urutan elusi, dari pertama sampai terakhir, pada
steroid-steroid berikut ini dari kolom ODS dg fase gerak
metanol/air (70:30)

Nandrolone
Methyltestosterone
 Teknik Elusi

❖Isokratik:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak tetap (polaritas tetap) selama proses
kromatografi berlangsung

❖Gradien:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)
selama proses kromatografi berlangsung
54 HPLC-2011
Teknik Isokratik

55 HPLC-2011
Eluen= campuran A + B

50 % B

40 % B

56 HPLC-2011
30 % B

35 % B

57 HPLC-2011
 Teknik Gradien
Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,
kemudian dilakukan
teknik elusi gradien

58 HPLC-2011
Hasilnya

59 HPLC-2011