HPLC II

Indah Solihah
 Normal-Phase HPLC
[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

▪ Senyawa polar:
- terelusi belakangan (tR panjang)
- semakin non-polar fase gerak,
tR senyawa polar makin panjang

▪ Solven:
- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

▪ Eluent strength:
- dimodifikasi dengan n-heksan
2 HPLC-2011
 Reversed-Phase HPLC
Reversed-Phase HPLC
[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]

▪ Senyawa polar:
- terelusi lebih dahulu
▪ Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar
lebih kuat tertahan
▪ Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra-
hidrofuran
▪ Eluent strength:
- dimodifikasi dengan air
(Kellner dkk., 1998)

3 HPLC-2011
Perkirakan urutan elusi, dari pertama sampai terakhir, pada
steroid-steroid berikut ini dari kolom ODS dg fase gerak
metanol/air (70:30)

Nandrolone
Methyltestosterone
 Teknik Elusi

❖Isokratik:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak tetap (polaritas tetap) selama proses
kromatografi berlangsung

❖Gradien:
- teknik elusi menggunakan komposisi fase
gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah)
selama proses kromatografi berlangsung
5 HPLC-2011
Teknik Isokratik

6 HPLC-2011
Eluen= campuran A + B

50 % B

40 % B

7 HPLC-2011
30 % B

35 % B

8 HPLC-2011
 Teknik Gradien
Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas,
kemudian dilakukan
teknik elusi gradien

9 HPLC-2011
Hasilnya

10 HPLC-2011
 Detektor
Bagaimana
Memilih detektor
dan
Apa pertimbangannya

???
 Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2
golongan yaitu:
➢detektor universal (yang mampu mendeteksi zat
secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak
bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan
detektor spektrometri massa;
➢detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
 Detektor HPLC
❖Bulk property detector (BPD) :
- mengukur sifat solute dan fase gerak
contoh : detektor indeks bias ( RI )

❖ Solute property detector (SPD) :

- hanya mengukur sifat solute
- 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD
Contoh : detektor UV
 Syarat Detektor :
• Cukup sensitif
• Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi
• Respon linear terhadap solut
• Waktu respon pendek sehingga tidak
bergantung flow rate (kec.alir)
• Mudah digunakan
• Tidak merusak sampel
 Detektor UV
• Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana
pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut
sedangkan sampel menyerap dengan kuat.
• Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan
satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor
dengan λ yg dapat diubah-ubah antara 200-700
nm
• Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar
• Detektor ini hanya bekerja jika senyawa
mempunyai kromofor
Kromofor UV-HPLC
Kromofor UV-HPLC
 Detektor UV
❖ Untuk keperluan analisis komponen utama
dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan
minimal nilai  senyawa harus ≥ 10 M-1. cm-1
pada  ≥ 185 nm.
❖ Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-
UV diperlukan minimal nilai  senyawa harus
≥ 1000 M-1. cm-1
❖ Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV,
senyawa dengan nilai  senyawa  100 M-1.
cm-1 tidak mungkin dilakukan
UV / Visible detector
Advantages
• High sensitivity & small
sample volume required
• Can be used with gradient
elution
• Is relatively cheap and not
sensitive to temperature
• Sensitive to large number of
organic compounds
Disadvantages
• Does not work with
compounds that do not absorb
light at this wavelength region
• Cannot be used with the
solvents having large
absorption in the UV region
• Cannot be used for the sample
components which cannot be
absorbed in the UV region
21
 Detektor PDA
• Mampu memberikan kumpulan kromatogram
secara simultan pada panjang gelombang yg
berbeda dlm sekali proses (single run)
• Pada kromatogram dapat pula ditampilkan
spektrum UV shg dpt digunakan untuk
memilih λmaks utk sistem HPLC
• Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan
ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi,
panjang gelombang, dan waktu)
 Detektor Fluoresensi
• Merupakan detektor yg paling peka, tetapi
hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa
berfluorisensi, karena itu kadang2 solut
diubah menjadi turunan senyawa yg
berfluorisensi sebelum dikromatografi
Detektor UV vs Fluorescen

UV

Fluorescen

26 HPLC-2011
 Luminescence

Bagaimana terjadinya fluorescensi ???

Fluorescensi

27 HPLC-2011
Fluorescene detection
• Compared to UV-VIS
detectors fluorescence
detectors offer a higher
sensitivity and selectivity excitation emission
that allows to quantify
and identify compounds
and impurities in complex Mobile phase
matrices to extremely low
concentration levels
(trace level analysis)
• Fluorescence detectors
sense only those
substances that fluoresce
suwedo hadiwiyoto basic principles of HPLC - 1 28
 Derivatisasi

Apa arti derivatisasi … ?

Apa tujuannya … ?
Bagaimana caranya … ?
Derivatisasi Post-/Pre-column … ?

HPLC-2011 29
 Tujuan Derivatisasi
❖Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa
dengan pereaksi (agen) penderivat untuk
menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

❖Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa

dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-
kromofor → senyawa berkromofor)

❖Meningkatkan daya deteksinya (senyawa

berkromofor UV → senyawa berkromofor
fluorescensi)

30 HPLC-2011
 Syarat reaksi derivatisasi
1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap
baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa
berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan
spektrofluorometri;
2. Proses derivatisasi harus cepat dan
menghasilkan produk yang sebesar mungkin
(100 %);
3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama
proses derivatisasi dan deteksi;
4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak
menganggu pemisahan kromatografi.
 Captopril
HS CH3
O

N COOH

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC

dengan detektor UV ?
32 HPLC-2011
 Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide

HS CH3
O
O
N COOH + Br C-CH2-Br

E
t
i
Captopril l p -Br fenacylbromide
a
m
i
33
n HPLC-2011
 Hasil derivatisasi :
Captopril + p -Br Fenacylbromide

HS CH3
O
O O
N C-O-CH2-C Br

Dapat dideteksi secara UV

34 HPLC-2011
 Gabapentin
O
H2 N C
OH

R-NH2

Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau

Fluorescen ?

35 HPLC-2011
 Derivatisasi dg Dansilklorid

H3 C CH3 H3C CH3

N N

+ R-NH2

- HCl

O=S=O O=S=O

Cl NH

R
Dansil klorid
HPLC-2011 Fluorescent derivative 36
Contoh Senyawa
Asli
Yang
Berfluorescensi
Kunang-kunang

38 HPLC-2011
Fluorescensi

39 HPLC-2011
Asam Salisilat

O
C
OH

H
O
As.Salisilat - Fluorescensi

O
C
OH

H
O
 Papaverin HCl

H3CO

OCH3
N
H3CO .HCl
CH2 OCH3
 Riboflavin
OH OH OH
CH2-CH-CH-CH-CH2OH

H 3C N N O

NH
H3C N
O
44 HPLC-2011
 Detektor Indeks Bias
• Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda
• Detektor mengukur perbedaan antara indeks
bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg
keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan
oleh adanya solut.
• Detektor ini tidak dapat dipakai untuk elusi
bergradien karena indeks bias sistem berubah
selama kromatografi
• Sangat sensitif terhadap perubahan suhu
Refractive index (RI) detection
• The ability of a compound or
solvent to deflect light provides
a way to detect it
• The RI is a measure of
molecule’s ability to deflect
light in a flowing mobile phase
in a flow cell relative to a static
mobile phase contained in a
reference flow cell
• The amount of deflection is
proportional to concentration
• The RI detector is considered to
be a universal detector but it is
not very sensitive

basic principles of HPLC - 1 46

 Detektor Elektrokimia
• Detektor ini menggunakan sifat redoks solut
untuk mengukur kehadiran solut tersebut.
• Memiliki kepekaan yg tinggi
• Fase gerak harus polar dan mengandung
elektrolit pendukung
 Detektor Spektrometri Massa
• Untuk identifikasi senyawa murni
• GC-MS : terjadi pola fragmentasi
• LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi
• Data berupa berat molekul, terkadang
ditambah berat molekul pelarut
 Bentuk Kromatogram

❖Bentuk kromatogram (peak) ada berma-

cam-macam, a.l:
- tailing, fronting (leading)
- asimetri, simetri
- pecah
- lainnya

49 HPLC-2011
 Peak Tailing Peak Fronting

Possible cause: Possible solution: Possible cause: Possible solution:

Dilute sample 1:10

Check all fittings,
Overloading of and rerun or use a
Dead volume in flow especially post-
column larger capicity
path column and at the
column
column head
Run high organic
through column,
Remake mobile phase Column is poorly
Mobile phase too then equilibrate and
or increase acid packed
weak retry, or replace
concentration
column
 Peak asymmetry - tailing

USP

HPLC-2011 51
 Peak Asymmetry vs Tailing

Baca:
Snyder dkk., 1997
HPLC-2011 52
 Kriteria Peak

HPLC-2011 54
 Pengatasan Peak Tailing
❖Tambahkan 30 mM:
- Trietilamin (utk seny. basa)
- Amonium asetat (utk seny. asam)

❖ Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil-

amin dengan:
10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil-
amin asetat

❖ Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g

Bagaimana mekanisme kerja
TEA mencegah tailing ?
55 HPLC-2011
 Tailing Senyawa Basa
❖Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam
kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat
dengan senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati
kolom tersebut.

❖Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin

modifier ke dalam campuran fase gerak, misal:
trietilamin [ TEA ].

❖TEA akan me-masking residu Si-OH, sehingga

saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi
ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat
memperkecil terjadinya tailing.
56 HPLC-2011
 Penggunaan TEA
❖Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak.
Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi
residu silanol pada kolom RP-18.

❖Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !

Perhatikan:
pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan

fase gerak yang mengandung TEA

57 HPLC-2011
 Broad Peaks

Possible cause: Possible solution:

Overloading of column Dilute sample 1:10 and rerun

Modify gradient so that peaks elute

Retention time too long
earlier

Reduce tubing diameters and lengths

Extra-column volume too large where possible, particularly post-
column

"Dead" volume Check all connections for proper fit

Detector time too slow Increase detector Hz rate

 Peak Doubling

Possible cause: Possible solution:

Dilute sample 1:10 and rerun or use a higher capacity

Overloading of column
column

Inject less than 1/6 of the column volume, or increase

Sample volume too large
sample concentration

Check all fittings, in particular post-column and at the

Dead volume in flow path
column head

Run high organic through column, equilibrate and

Problems internal to column
retry, or replace column

Clogged sample filter Replace filter

Mekanisme Pemisahan
 Kromatografi Adsorpsi
• Pemisahan menggunakan fase normal atau
mekanisme pemisahan secara afinitas
(kromatografi afinitas)
• Sering terjadi tailing
• Fase gerak dimodif dengan penambahan
pelarut polar (air, metanol, etanol)
• Detektor UV lazim digunakan
 Kromatografi Partisi
• Pemisahan menggunakan fase terbalik
• Pemisahan dilakukan untuk senyawa2 yg
bersifat asam lemah atau basa lemah
• Fase gerak harus dijaga pH-nya dengan buffer
agar analit tidak terionisasi
 Kromatografi Penukar Ion
• Fase diam dapat menukar kation atau anion
dg fase gerak
• Fase gerak mengandung air untuk proses
ionisasi
• Retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase
gerak
 Kromatografi Eksklusi Ukuran
• Prinsip pemisahan berdasarkan ukuran
molekul fase gerak
• Digunakan untuk memisahkan senyawa dg
BM>2000 dalton
• Fase diam berupa silika atau polimer yg
bersifat porus