ANALISIS DENGAN TLC

SCANNER/DENSITOMETER
Penggunaan TLC Densitometer

TLC Densitometer digunakan untuk:

• Analisis Kualitatif
• Analisis Kuantitatif
 Analisis Kualitatif dan Kuantitatif
• Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu
retensinya atau Rfnya,
• Analisis kuantitatif dilakukan penyarian/ekstraksi dari
bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji secara
spektroskopi.
• Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji.
Sinar mono
Intensitas Serapan

kromatis
Profil spektrogram

`
Bercak

Panjang gelombang (nm)

 Cara Ekstraksi
• Bercak pada lempeng yang dilihat di bawah sinar UV
diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil, kemudian
diambil lapisan tipis bersama bercaknya.

• Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas beker,

ditambah pelarut yang sesuai (etanol/ kloroform 
tergantung senyawa yang mau diidentifikasi), diaduk, dan
setelah larut, disaring.

• Filtrat dimasukkan ke dalam labu takar, dan diadkan

hingga tanda batas

• Larutan siap diuji dengan alat spektrofotometer UV-Vis.

 Disaring Diencerkan
Dilarutkan

• Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang serapan maksimumnya.

• Pengenceran merupakan faktor penting untuk perhitungan

kadar senyawa yang diuji secara kuantitatif.
 TLC Plate

HPTLC Plate
Thin Layer chromatography (TLC)

Absorpsi radiasi UV proporsional (sebanding) dengan konsentrasi

analit

Menghitung kadar (kuantitatif) mungkin untuk dilakukan

 Example: anthraquinone derivatives

4 major anthraquinone derivatives found

in a species of indian rhubarb

Varied bioactivities (antioxidant,

antifungal, antimicrobial, antiviral, etc)

Compound R1 R2

1. Physcion H OCH3
2. Chrysophanol H H
3. Emodin H OH
4. Chrysophanol Glc H
Glycoside

RP-18 thin layer

methanol – water – formic acid 80:19:1 (v/v/v)
UV-densitometry at 445 nm

Singh et al., J. Chromatogr. A, 1077 (2005) 202-206

HASIL SCANNING SATU
BERCAK
 Scanning senyawa yang berbeda

Digunakan metode:
• Satu persatu dgn pjg gelombang serapan maksimumnya.
• Cara serentak, dgn menggunakan pjg gelombang yang dapat
dimiliki oleh semua senyawa.
 Hasil Rekaman

• Hasil
Proses Scanning bercak noda
• Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda

13
• Scanning serentak beberapa puncak/bercak

14
MENGHITUNG WAKTU RETENSI

Rf = a/c (cm)
b/c (cm)

Arah scanning
Contoh 1
• Analisis golongan tetrasiklin, dengan fase diam : selulosa F,
Fase gerak : larutan MgCl2 0,25 M. (Nornendy, 1993).

. . . . . . . . . . .
0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0
Kromatogram tetrasiklin dan turunannya dilihat dinbawah
sinar UV, 366 nm
1. Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat),
2. Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu)
3. Tetrasiklin HCl Rf =0,73 (merah ungu)

17
17
TETRASIKLIN

H3C CH 3
N
H3C CH 3
OH
7 6 5 4
8 3
D C B A
9 2 O
10 11 12 1
C
OH
Tetrasiklin OH
C22H24N2O8
O OH O
sda
NH 3

Klortetrasiklin C22H23N2O8Cl 7-Cl

Oksitetrasiklin C22H24N2O9 5-OH

Struktur Kimia
 Penjelasan Tetrasiklin
• Turunan tetrasiklin dapat membentuk khelat dengan
logam bervalensi +2 sehingga tidak akan baik bila
digunakan silika gel GF.

• Tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks

dengan Ca++ sehingga tidak dapat dielusi sempurna.

• Bila digunakan selulosa sebagai fase diam, terdapat

batas kelarutan dalam selulosa, dan terjadi ikatan
hidrogen.

• Dengan eluen larutan MgCl2, tetrasiklin dapat

membentuk ikatan kompleks lebih baik dibanding
20
20
yang lain.
Analisis Kualitatif

• Analisis kualitatif dengan TLC-Densitometri pada

prinsipnya mengacu kepada nilai Rf (Retardation factor)
atau faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit
dengan Rf baku pembanding atau membandingkan
bercak kromatogram sampel dengan kromatogram
"Reference Standart" (Rs) yang dikenal dengan : Factor
Retensi Relatif (Rx)

• Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan

bersamaan dengan sampel pada pelat yang sama.
• Contoh 2.
Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel,
fase gerak : campuran n-isopropil etilasetat dan amoniak 10%
(65:75:60) ( Wulan dkk, 1991)

. . . . . . . . . . .
0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0
Kromatogram zat warna lipstik
1. Tartasin Rf =0,12 (merah muda)
2. Kuning AB Rf= 0,48 (kuning)
3. Kuning OB Rf =0,67 (kuning hijau)
4. Oranye I C, Rf=0,88 (putih)
5. Poncou SX, Rf=0,98 (kemerahan)
Struktur Kimia
 Penjelasan Zat Warna

• Berdasarkan kepolarannya adalah : tartrazin poncou,

oranye I, kuning AB, kuning OB (paling kurang larut
dalam air).

• Fase gerak berupa amoniak 10%, maka tartrazin kurang

larut dalam fase gerak, tetapi mudah larut dalam pelarut
organik. Tartrazin sifat basa lebih kuat, dari pancou
sehingga paling lambat migrasinya dalam suasana basa
(amoniak 10%).

• Bila zat warna tidak discanner, tetapi bercak disari

kemudian diencerkan etanol sampai 5,0 ml. Larutan yang
didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang serapan maksimumnya: 24
24
Analisis Kuantitatif

• Analisis kuantitatif hampir sama dengan

spektrofotometri, penentuan kadar analit dikorelasikan
dengan area bercak pada pelat KLT.

• Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan :

– Standar tunggal (Membandingkan area bercak analit dengan
area bercak baku pembanding yang diketahui konsentrasinya)
– Kurva kalibrasi (mencari nilai x dari persamaan regresi linear
yang dihasilkan oleh kurva kalibrasi
Standar Tunggal

Membandingkan area bercak analit dengan area bercak

baku pembanding yang diketahui konsentrasinya.
• =

Cx = konsentrasi analit
Ax = Luas area analit
As = Luas area standar/baku pembanding
Cp = konsentrasi standar/baku pembanding
Kurva kalibrasi

• Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot luas area

bercak terhadap konsentrasi dari satu seri larutan
standar/baku pembanding.
• Kurva yang terbentuk harus linear, kemudian dengan
persamaan garis/regresi linier dapat ditentukan kadar
analit.
• Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan luas
area noda plat TLC akan lebih terjamin keakuratannya
dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda
kromatogram diukur pada posisi diam atau “zig-zag”
menyeluruh.
Analisis Kuantitatif
dengan standar Tunggal
• Seorang TTK melakukan analisis kadar kafein di dalam
sediaan kopi dan dibandingkan dengan standar kafein
100 ppm. Setelah dilakukan elusi pada eluen
kloroform:metanol (8:2) diperoleh bercak noda dan
standar kafein kemudian plat discan menggunakan TLC
Scanner. Dari percobaan tersebut diperoleh data
sebagai berikut
Nama sampel Rf Luas Area (mV)
Baku kafein 0,65 98,76
Kopi 0,64 45,73

• Berapakah konsentrasi (ppm) kafein pada sampel

tersebut?
Diketahui Cs = 100 ppm
As = 98,76
Ax = 45,73
Berapa Cx..???

• Cx = Ax / As x Cs
• Cx = 45,73/98,76 x 100
• Cx = 46,30 ppm
Contoh soal

• Seorang TTK melakukan analisis kadar paracetamol di

dalam obat panadol dan dibandingkan dengan standar
paracetamol 5 mg/100 ml. Setelah dilakukan elusi pada
eluen kloroform:etanol (3:7) diperoleh bercak noda dan
standar paracetamol kemudian plat discan
menggunakan TLC-Scanner. Dari percobaan tersebut
diperoleh data sebagai berikut
Nama sampel Rf Luas Area (mV)
Paracetamol 0,78 988,76
Panadol 0,77 450,73

• Berapakah Konsentrasi (ppm) paracetamol pada sampel

tersebut? Hitung %kadar PCT dalam sampel jika
diketahui konsentrasi sampel awal 50 ppm.
 Analisis Kuantitatif
• Analisis kuantitatif diperlukan senyawa standar/baku pembanding,
dan dibuat kurva regresi linier.
• Untuk menguji tetrasiklin yang tidak mengalami degradasi
digunakan cara analisis dengan TLC
• Dibuat kurva baku hubungan kadar (mcg/ml) dan luas puncak
(mV).
Konsentrasi Luas area (mV)
(mcg/ml)
0,0 1,96
5,0 8,5468
10 13,6856
15 19,0454
20 23,9754
25 29,356
53
30 38,675
Kurva Kalibrasi

45
40
35 f(x) = 1.15752285714286 x + 1.95775714285714
R² = 0.991163180082302
Luas Area (mV)

30
25
20
15
10
5
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Kadar (mcg/ml)
Penentuan Kadar Tetrasiklin
• Persamaan kurva kalibrasi dari kromatogram yang
didapat pada pengamatan tetrasiklin mempunyai
persamaan regresi linier sebagai berikut:
• Y = 0,513 X + 1,487, R= 0,9996
• Jika luas area pada sampel= 24,487 mV. Hitung
konsentrasi tetrasikilin dalam sampel tersebut.

33
Penentuan Kadar Tetrasiklin
• Y = 0,513 X + 1,487, R= 0,9996
• Jika,
Luas area pada sampel= 24,487 mV,
Maka harga X :
Y = 0,513 X + 1,487
24,487 = 0,513 X + 1,487
X = (24,487-1,487)/ 0,513
= (23)/ 0,513
=44,834 mcg/ ml

34
• Untuk analisis kuantitatif zat warna tidak discanner tetapi
bercak disari kemudian dilarutkan dengan etanol, dan
diencerkan hingga tanda batas

• Cara penyarian, pemisahan dan pengenceran harus

optimal.

• Untuk membuat kurva baku diperlukan lempeng yang

besar untuk elusi senyawa baku yang berbeda
kadarnya.

35
Yang perlu Diperhatikan Dalam uji
Kuantitatif

1. Pemisahan antara obat

2. Linearitas kadar yang dapat diuji
3. Ketelitian hasil
4. Ketepatan hasil.
Hasil penelitian Rhodamin
a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)
No Nama Sampel Warna Benang Wol Hasil
Uji
1 Kerupuk bunga Merah muda +
(tersanjung)
2 Kerupuk bawang Tidak merah muda -

3 Kerupuk ketela Merah muda +

4 Kerupuk rengginang Tidak merah muda -
ketan
5 Kerupuk rengginang Tidak merah muda -
beras
6 Kerupuk slondok Tidak merah muda +

7 Kerupuk unyil Merah muda +

8 Kerupuk taro Tidak merah muda -

9 Kerupuk lotek Tidak merah muda -

10 Kerupuk angin Tidak merah muda -

Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan 366 nm

Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nm

a. Kerupuk ketela
b. Kerupuk bunga (tersanjung)

c. Kerupuk unyil
A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml) Luas Area (milivolt)
0,005 0,7092
0,015 0,8493
X = 0,023 mg/100 ml
0,030 0,8582
0,060 2,8790
0,090 3,2248
0,120 4,5278

2. Sampel kerupuk ketela

Replikasi Luas area (milivolt)
1 1,3010
2 1,0251
3 1,1926
4 1,4120
5 1,2412
6 1,0307
7 0,7282
B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga
1. Standar Rhodamin B
Kadar Luas area Replikasi Luas area (milivolt)
(mg/100ml (milivolt)
)
0,005 0,4425 1 2,1328
0,015 1,1420
2 1,7314
0,030 1,5273
0,060 3,0667 3 1,2856
0,090 4,2450
4 1,4730
2.0,120
Sampel 5,1967
kerupuk bunga
5 1,0555

6 1,0966

7 0,6985
• Hitung konsentrasi (ppm) rhodamin yang ada di sampel
kerupuk bunga…??
• Jika diketahui konsentrasi awal sampel 50 mg/25 ml,
tentukan % kadarnya
•  X = 0,023 ppm
• %kadar = C analit/C sampel awal x 100%
= 0,023 ppm/ 2000 ppm x100%
= 0,00115%
C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil
1. standar Rhodamin B

Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt)

0,005 0,4865
0,015 0,9649
0,030 1,3910
0,060 1,6812
0,090 2,1991
0,120 2,2197

2. Sampel kerupuk unyil

Replikasi Luas area (milivolt)

1 0,5340
2 0,7687
3 0,5636
4 0,5116
5 0,5502
• Hitung kadar rhodamin yang ada di kerupuk unyil,,,,??
SOAL LATIHAN

• Adapun bercak noda pada sampel muncul pada Rf= 6,5

dengan luas area sebesar 395 mV. Dari data diatas
diketahui persamaan garis kurva baku y = 6,9733x + 69
dengan R2 = 0,9956. Hitunglah konsentrasi paracetamol
(mg/L) dalam sampel tersebut?

Paracetamol
tR C (mg/L) LA(mV)
6,5 15 185
6,4 30 260
6,5 45 386
6,5 60 490
6,6 75 570
 Quercetin
tR C (mg/L) LA(mV)
5,8 2 120
5,8 4 210
5,7 8 347
5,7 10 432
5,8 12 520

Data sampel
tR LA (mV)
2,6 120
5,7 475
3,5 96

• Dari data diatas diketahui persamaan garis kurva baku y = 39,058x

+ 44,581
R² = 0,9976. Hitunglah konsentrasi (mg/L) quercetin pada sampel tsb?
END
Kesimpulan penggunaan HPTLC
a. HPTLC dapat digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis campuran senyawa antara 20 sampai 30
senyawa.
b. Biaya pemeliharaan, operasional, jauh lebih murah dari
HPLC.
c. Cara deteksinya bercak(senyawa) pada lempeng lebih
banyak pilihan dari HPLC walaupun dengan pereaksi
warna.
d. Pemisahan yang terjadi pada HPTLC lebih dari 10 menit,
sedangkan HPLC mungkin lima menit sudah selesai.
e. Ketilitian dan ketepatan mendekati HPLC.

48