Pemisahan Zat

Secara
KROMATOGRAFI
Oleh:
Pramita Yuli Pratiwi, M.Sc., Apt.
KROMATOGRAFI
• Kromatografi berasal dari bahasa Yunani, yaitu Chromato
(warna) dan Grafe (tulisan).
• Dasar pemisahan: perbedaan kecepatan migrasinkomponen
(senyawa-senyawa) yang dibawa oleh fase gerak dan ditahan
secara selektif oleh fase diam.
• Tujuan: pemisahan senyawa-senyawa dengan waktu yang
tidak terlalu lama.
• Untuk memisahkan golongan utama kandungan dalam suatu
tanaman, maka dibutuhkan teknik pemisahan. Dimana
pemisahan tersebut merupakan suatu prosedur yang
berdasarkan perbedaan kepolaran yang dapat digunakan.
Sejarah Kromatografi
• Runge, F.F. (1834-1843) → melakukan spot tes campuran zat
warna dari ekstrak tumbuh-tumbuhan pada pita kain dan atau
kertas.
• Goppel Sroeder, F. (1868) → menganalisa zat warna,
hidrokarbon, alkohol-alkohol, beer, milk pada minuman dan
air minum menggunakan kertas.
• Day, D.T. (1897-1903) → kolom diisi serbuk tanah untuk
pemisahan.
• Mikhail Tswett (1906-1907) → berhasil memisahkan pigmen
kloroplas dengan fase diam CaCO3 dan PE sebagai fase gerak.
Penamaan umum didasarkan
keadaan FG dan FD

• GLC (Gas Liquid Chromatography), FG: Gas, FD: Liquid.

• GSC (Gas Solid Chromatography), FG: Gas, FD: Solid.
• LLC (Liquid Liquid Chromatography), FG: Liquid, FD: Liquid.
• LSC (Liquid Solid Chromatography), FG: Liquid, FD: Solid.
Pembagian Kromatografi secara
Umum
KROMATOGRAFI PLANAR
Ada 3 macam yaitu
• Kromatografi Lapis Tipis (KLT),
• Kromatografi Kertas (KKt.), dan
• Kromatotorn
Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Banyak digunakan karena:
• sederhana, mudah difahami secara teknik.
• waktu analisis relatif pendek, dapat diulangi setiap saat.
• ekonomis.
Mekanisme pemisahan:
• adsorpsi
• Partisi

Dalam KLT dgunakan fase diam (FD) dan fase gerak (FG).
Fase Diam
a. Silika Gel
• G : sbg pengikat digunakan gypsum, bila bertemu dengan air
maka akan mongering.
• S : sbg pengikat digunakan pati, merupakan pengikat tapi
stagnance.
• GF 254: ditambah gypsum dan senyawa berpendar pd pjg
gelombang UV 254.
• H atau N: tanpa pengikat
• silika gel tanpa pengikat tetapi dengan senyawa berpendar,
merupakan fase diam yang dapat diamati langsung dengan
mata telanjang maka digunakan GF yang dapat berfluoresensi.
• silika gel utk keperluan preparatif.
b. Alumina
• alumina asam (pH 4), netral (pH 7), basa (pH 9).
• pemberian kode seperti silika gel G,H,P,F.
• Umumnya yang digunakan adalah yang bebas air, sehingga
mempunyai aktivitas penyerapan lebih tinggi. Alumina jarang
digunakan, dan bila akan digunakan harus diaktivasi terlebih dahulu
dengan pemanasan
c. Selulosa
• Serat 2 – 20µ, serat asli, mikrokristal (Avicel) utk senyawa polar. Dg
atau tanpa senyawa fluorescence.
• Polaritasnya tinggi sehingga dapat digunakan sebagai pemisah
secara partisi, baik dengan bentuk kertas maupun lempeng. Ini
digunakan untuk senyawa yang polar.
Fase Gerak
Sedangkan dalam pemilihan fase gerak perlu diperhatikan, antara
lain:
• Interaksi polaritas
• Deret Eluotropik
• Perkiraan polaritas campuran pelarut
Deret Eluotropik
Syarat pelarut/FG
• Harus murni dan mudah didapatkan.
• Mantap di udara.
• Mudah bercampur dg pelarut lain.
• Tidak toksis
• Mudah dipisahkan dari linarut untuk pemurnian.
PENYIAPAN DAN PENOTOLAN
SAMPEL
• Pelarut sampel yang sesuai
• 1 – 2 µl yang mengandung 50 – 100 µg, d: 3–6mm
• Alat penotol: kapiler gas, mikrosyringe
• Overloaded, membuat Rf berubah dan bercak tidak simetri.
• Rf = jarak yang ditempuh seny sampel
jarak yang ditempuh FG
HRf = Rf x 100
• Teknik penotolan harus diperhatikan agar totolan tidak terlalu
lebar dan pekat,
• bila bercak lebar dan tipis, setelah dielusi menjadi lebih encer
dan tidak teramati.
• Sebaliknya bila terlalu pekat hasil elusi tidak lagi bulat tapi
memanjang (tailing), sehingga senyawa yang mempunyai
selisih Rf kecil tidak terlihat pemisahannya.
• Perlu diperhatikan bahwa ujung penotol tidak boleh
menggores lapisan agar tidak mengganggu cairan elusi.
Tailing
PENGEMBANGAN (ELUASI)
• Bejana diisi FG hingga kedalaman 0,5 cm→dijenuhkan dengan
kertas saring untuk menyamakan tekanan uap pada seluruh
bagian bejana.
• Totolan (sdh kering) pada plate, dimasukkan bejana.
• Totolan jangan tercelup fase gerak.
• Batas yang dicapai gerak ditandai dg pensil lemah.
• Didokumentasikan profil kromatogramnya (Rf)
• Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan
bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari
pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi
oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap
mencegah penguapan pelarut.
 • Karena pelarut
bergerak lambat pada
lempengan,
komponen-
komponen yang
berbeda dari
campuran pewarna
akan bergerak pada
kecepatan yang
berbeda dan akan
tampak sebagai
perbedaan bercak
warna.
Gambar menunjukkan lempengan setalah pelarut
bergerak setengah dari lempengan.
Pengukuran bercak
Ketika pelarut mendekati
bagian atas lempengan,
lempengan dipindahkan
dari gelas kimia dan posisi
pelarut ditandai dengan
sebuah garis, sebelum
mengalami proses
penguapan.
Rf (Retardation Factor)

• Didefinisikan sebagai angka banding

antara jarak tempuh bercak dari
tempat totolan terhadap jarak
tempuh eluen
• Dalam penentuan Rf, letak bercak
komponen diukur dari pusat bercak.
Harga Rf adalah spesifik untuk masing-
masing senyawa, karena ditentukan
oleh koefisien distribusinya. Apabila
sampel mengandung komponen yang
struktur kimianya hampir sama, maka
akan diperoleh bercak dengan harga
Rf yang berdekatan.
• Harga Rf dari komponen sampel kemudian dibandingkan
dengan harga Rf senyawa baku yang dielusi pada kondisi yang
sama. Apabila harga Rf keduanya relatif sama maka dapat
diduga bahwa sampel mengandung senyawa yang sama
dengan senyawa baku. Guna memastikan hasil analisis
kualitatif tersebut di atas, seringkali diperlukan data analisis
kualitatif metode lain sebagai data pendukung.
• Harga Rf yang dihasilkan seringkali berbeda dari Rf yang
dimuat dalam literatur, karena harga ini ditentukan oleh
kondisi percobaan seperti tempertur, ukuran spot, kualitas
kertas, kejenuhan bejana, dll. Oleh karena itu, bila harga Rf
dibuat daftar untuk dipublikasikan maka semua kondisi yang
digunakan dalam elusi harus dipaparkan.
Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari
1.7 cm dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm,
sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi:
• Jika percobaan ini diulang pada kondisi yang tepat sama, nilai
Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama.
• Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna merah selalu adalah 0.34.
Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan
sebagainya), nilai tersebut akan berubah.
• Teknik ini harus tetap diingat/didokumentasikan jika ingin
mengidentifikasi pewarna yang tertentu.
Faktor-faktor yang menentukan harga Rf
• Eluen. Perubahan yang sangat kecil komposisi eluen dapat menyebabkan
perubahan harga Rf, karena perubahan komposisi eluen akan mempengaruhi
koefisien distribusi.

• Suhu. Perubahan suhu akan mempengaruhi harga koefisien distribusi dan

kecepatan aliran eluen.

• Ukuran bejana. Volume bejana akan mempengaruhi homogenitas atmosfer

dalam bejana dan pencapaian tingkat kejenuhan bejana. Jika digunakan bejana
besar maka ada tendensi elusi terjadi lebih lama, terjadi perubahan komposisi
pelarut sepanjang kertas, sehingga akan mempengaruhi koefisien distribusi.

• Kertas. Ketebalan dan kerapatan kertas akan mempengaruhi kecepatan aliran

sehingga akan mempengaruhi kesetimbangan partisi.

• Sifat campuran. Berberapa senyawa akan mengalami partisi di antara volume-

volume yang sama dari fase diam dan fase gerak, sehingga hampir selalu
mempengaruhi karakteristik kelarutan satu terhadap yang lain
IDENTIFIKASI
• Secara langsung
Dilihat secara visual untuk senyawa-senyawa yang berwarna. Misalnya
kurkumin.

• Dengan perlakuan:
- Destruksi
Metode ini mengubah bercak cuplikan secara irreversible, dan dipakai untuk
KLT kualitatif dan beberapa jenis KLT kuantitatif. Misalnya: dengan
penyemprotan I2 1% dalam mentol, sebagian besar senyawa organic tampak
berupa bercak coklat jika mengandung atom O2 atau lembayung jika tidak
mengandung atom tersebut.
- Non-destruksi
Metode ini membiarkan komponen cuplikan utuh dan harus dipakai untuk KLT
preparative dan beberapa jenis KLT kuantitatif dan kualitatif. Caranya dengan
dilihat pada sinar UV, maka akan tampak bercak pada lempeng KLT.
Bagaimana halnya jika substansi yang ingin anda analisis tidak
berwarna?
Ada dua cara untuk menyelesaikan
analisis sampel yang tidak berwarna
• Menggunakan pendarfluor (sinar UV)
• Penunjukkan bercak secara kimia
Menggunakan Pendarfluor (sinar
UV)
• Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali
memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet
(UV). Itu berarti jika sinar UV disinarkan maka akan berpendar.
• Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada
kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak
tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa
jika sinar UV disinarkan pada lempengan, akan timbul
pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-
bercak.
• Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
SementaraUV tetapdisinarkanpada lempengan, posisi-posisidari bercak-bercakditandai
denganmenggunakanpinsildan melingkaridaerahbercak-bercakitu. Seketikaanda
mematikansinar UV, bercak-bercaktersebut tidak tampak kembali.
Pengertian Luminescence.
Fluorescence
- utk senyawa organik.
- kode F366, UV 366.
- contoh: fuorescein dan garamnya, rhodamin B dan rhodamin 6G, dll.

Phosphorescence.
- utk senyawa anorganik.
- Pada UV 254

Indikator fosforesens anorganik:

- kode F 254, UV 254 : Zn cadmium sulfida.
- biru-seny timah strontium, kuning-uranil asetat, hijau kuning-mangan Zn
silikat.
- kode F254s: alkali tanah wolframat.
Penunjukkan bercak secara
kimia
• Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-
bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan
zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna.
• Contohnya adalah kromatogram yang dihasilkan dari
campuran asam amino.
• Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan
larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino
menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat
atau ungu.
Deteksi umum terpenoid dengan menggunakan pereaksi
semprot vanilin asam sulfat
Deteksi spesifik senyawa triterpen dengan pereaksi
semprot Liebermann-Burchard (LB)
Macam-macam pereaksi
warna/semprot dan
penggunannya
Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk
mengidentifikasi senyawa

• Misalkan ada campuran asam amino (sampel M) dan ingin

menemukan asam amino-asam amino tertentu yang
terkandung didalam campuran tersebut.
• Sampel M ditotolkan pada lempeng KLT dan bercak2 yang
serupa dari asam amino yang telah diketahui juga
ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi.
Kemudian dieluasi.
Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui
ditandai 1-5.
Gambar kanan menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan
disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena dengan mudah dapat
dibandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino
yang telah diketahui melalui posisi dan warnanya.
Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino 1, 4 dan 5.
KLT digunakan untuk analisis:
1. Kualitatif.
- menggunakan seny pembanding
- hitung Rf
2. Kuantitatif
- ketepatan dan ketelitian kurang dibanding kromatografi
gas dan HPLC.
- dibedakan 2, yaitu:
a. bercak lgsg diukur luasnya.
b. bercak dikerok kemudian dilarutkan dlm pelarut yg
sesuai.
Bagaimana kromatografi lapis tipis
berkerja?
Fase diam (silika Gel)
• Silika gel adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom
silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen
yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon
berlekatan pada gugus -OH.
• Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-
O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan
silika.
• Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya
van der Waals dan atraksi dipol-dipol.
• Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus –OH
• Gambar di atas menunjukkan bahwa silika gel (SiO2) merupakan rantai -O-Si-O- dimana
pada bagian permukaan silika berupa gugus-gugus hidroksil -OH, oleh karena itu silika
gel relatif bersifat polar. Oleh karena itu, KLT umumnya menggunakan sistem fase
normal. Namun tidak menutup kemungkinan bahwa dalam KLT digunakan sistem fase
terbalik.
Fase terbalik
• Dalam hal ini permukaan silika gel terlebih dahulu dimodifikasi agar
tidak lagi mengandung gugus hidroksil, melalui reaksi silanisasi
menggunakan dichlorodimethyl silane seperti terlihat pada gambar
dibawah.
• Semakin panjang rantai karbon yang diikatkan pada silika, maka
akan semakin hidrofobik.
Apa maksud: Silika Gel 60
GF254 atau Silika gel 60 UV254

• Ukuran pori : 60 Å (Amstrong)

• G : CaSO4.½ H2O sebagai binder (gypsum)

• F : bahan indikator fluorescence / fosforescence yg ditambahkan

• 254 : dituliskan sesudah F atau UV untuk menandakan λ eksitasi

bahan indikator fosforescence yang ditambahkan
KLT PREPARATIF
• Sampel 50 mg – 1 g.
• Sampel ditotolkan sbg pita/garis.
• Tebal optimum lapisan fase diam 1 – 1,5 mm.
• Visualisasi:
- non-destruktif.
- destruktif.
KROMATOGRAFI KERTAS (KKt.)
• Pada hakekatnya adlh KLT menggunakan kertas Whatman
no.1.
• FG: mirip KLT, biasanya menggunakan campuran pelarut polar.
Eg: BAW
• Air akan terikat kuat dg serabut selulosa (bnyk gugus OH), shg
air berfungsi sbg FD, sdgkn pelarut yg lain berfungsi sbg FG.
• Termasuk Kromatografi Cair-Cair.
• Mekanisme pemisahan: Partisi.
• Visualisasi mirip KLT, tetapi campuran H2SO4 dan asam kuat
lain tdk dpt digunakan.
• Baik digunakan untuk pemisahan senyawa polar (senyawa
biologi) seperti asam amino, gula dan nukleotida.
• Misalnya pada pemisahan senyawa turunan xantin, dg FG =
BAW
• Senyawa turunan Xantin:
Kofein. Rf = 0,65
Teofilin. Rf = 0,58.
Teobromin. Rf = 0,35.
• Maka dari yang paling polar:
Teobromin
Teofilin
Kofein.
Kenapa?
Karena FD polar karena ada air yang terikat pada serabut
selulosa, sehingga semakin kecil Rf maka semakin senyawa itu
polar karena terikat pada FD yang polar.
• Sekian.....
• Terima kasih...