ANALISIS DENGAN TLC

SCANNER/DENSITOMETER
 Analisis Kualitatif
• Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu
retensinya, atau dilakukan penyarian dari bercak setelah
dielusi, dan kemudian diuji secara spektroskopi.
• Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji.

Sinar mono
Intensitas Serapan

kromatis
Profil spektrogram
`
Bercak

Panjang gelombang (nm)

 Cara Ekstraksi
• Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV
diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil, kemudian
diambil lapisan tipis bersama bercaknya.

• Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala,

ditambah pelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk,
dan setelah larut, disaring.

• Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume sampai

tepat tanda (10,0 ml).

• Larutan siap diuji dengan alat spektrofotometer UV-Vis.

 Disaring Diencerkan
Dilarutkan

• Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang serapan maksimumnya.

• Karena pengenceran merupakan faktor penting untuk

perhitungan kadar senyawa yang diuji secara kuantitatif.
 TLC Plate

HPTLC Plate
Perbedaan TLC dan HPTLC

TLC HPTLC
10 - 25 µm 5 - 7 µm
Plate particle size:
Separation distance: 100 - 150 mm 60 mm
Development time: 30 - 200 min 3 - 20 min
Application: manual automated/semi-
automated
Development: manual automated
Derivatization: spraying dipping
Analysis data: no documentation fully documented
Quantitative analysis: no yes
Environment: no control no problems
Resolution: often poor very good
Procedure: flexible fully standardized
Reproducibility: impossible highly attainable
cGMP Compliant: usually not YES!!
Thin Layer chromatography (TLC)

Absorpsi radiasi UV proporsional (sebanding) dengan konsentrasi

analit

Menghitung kadar (kuantitatif) mungkin untuk dilakukan

 Example: anthraquinone derivatives

4 major anthraquinone derivatives found

in a species of indian rhubarb

Varied bioactivities (antioxidant,

antifungal, antimicrobial, antiviral, etc)

Compound R1 R2

1. Physcion H OCH3
2. Chrysophanol H H
3. Emodin H OH
4. Chrysophanol Glc H
Glycoside

RP-18 thin layer

methanol – water – formic acid 80:19:1 (v/v/v)
UV-densitometry at 445 nm

Singh et al., J. Chromatogr. A, 1077 (2005) 202-206

 Serangkaian Alat untuk uji dg TLC
Densitometer

TLC Linomat

TLC Scanner

TLC Chamber

TLC Visualizer
Penotol

• Penotolan

Pipa kapiler

Totolan
Totolan manual.
11
Chamber

10 ml
25 ml
 Chamber
Tempat elusi

Lempeng Silica gel

Bercak

Cairan elusi
13
TLC Scanner
HASIL SCANNING SATU
BERCAK
 Scanning senyawa yang berbeda

Digunakan metode:
• Satu persatu dgn pjg gelombang serapan maksimumnya.
• Cara serentak, dgn menggunakan pjg gelombang yang dapat
dimiliki oleh semua senyawa.
 Hasil Rekaman

• Hasil
• Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda

19
• Scanning serentak beberap puncak/bercak

20
MENGHITUNG WAKTU RETENSI

Rf = a/c (cm)
b/c (cm)

Arah scanning
TLC visualizer
Contoh 1
• Analisis golongan tetrasiklin, dengan fase diam : seluluse F,
Fase gerak : larutan MgCl2 0,25 M. (Nornendy, 1993).

. . . . . . . . . . .
0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0
Kromatogram tetrasiklin dan turunannya dilihat dibawah sinar
UV, 366 nm
1. Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat),
2. Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu)
3. Terasiklin HCl Rf =0,73 (merah ungu)

24
24
TETRASIKLIN

H3C CH 3
N
H3C CH 3
OH
7 6 5 4
8 3
D C B A
9 2 O
10 11 12 1
C

Tetrasiklin OH O
C22H24N2O8
OH
OH
O
sda
NH 3

Klortetrasiklin C22H23N2O8Cl 7-Cl

Oksitetrasiklin C22H24N2O9 5-OH

 Penjelasan Tetrasiklin
• Turunan tetrasiklin dapat membentuk khelat dengan
logam bervalensi +2 sehingga tidak akan baik bila
digunakan silika gel GF.

• Tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks

dengan Ca++ sehingga tak dapat dielusi sempurna.

• Bila digunakan selulosa sebagai fase diam, terdapat

batas kelarutan dalam selulosa, dan terjadi ikatan
hidrogen.

• Dengan eluen larutan MgCl2,tetrasiklin dapat

membentuk ikatan kompleks lebih baik dibanding
26
26
yang lain.
Struktur kimia

• Gambar
N(CH3)2 H3C N(CH3)2 H3C N(CH3)2
H3C OH
OH OH OH
O

OH CONH2 OHO CONH2 OH O O OHO

CONH2
OH O OH OH O
OH O
Anhidro Tetrasiklin Iso Tetrasiklin
Tetrasiklin NH2
HO SO3Na
-N=N- CH3
HC -N=N- -N=N-
CH3
SO3Na HO
Pomceo Kuning AB
Kuning no.3
Tartrazin CH3 SO3Na
NH2
SO3Na -N=N- Na O3S -N=N- -OH

Kuning OB (kuning no.4) Oranye I

27
27
Analisis Kualitatif

• Analisis kualitatif dengan KLT-Densitometri pada

prinsipnya mengacu kepada nilai Rf (Retardation factor)
atau Faktor retardasi yaitu : membandingkan Rf analit
dengan Rf baku pembanding atau membandingkan
bercak kromatogram sample dengan kromatogram
"Reference Standart" yang dikenal dengan : Factor
Retensi Relatif (Rx) 

• Untuk penentuan kualitatif dengan Rs harus dilakukan

bersamaan dengan sample pada pelat yang sama. 
• Contoh 2.
Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel,
fase gerak : campuran n-isopropil etilasetat dan amoniak 10%
(65:75:60) ( Wulan dkk, 1991)

. . . . . . . . . . .
0;0 0.1 0.2 0,3 0.4 0.5 0.6 0.7 08 0.9 1.0
Kromatogram zat warna lipstik
1. Tartasin Rf =0,12 (merah muda)
2. Kuning AB Rf= 0,48 (kuning)
3. Kuning OB Rf =0,67 (kuning hijau)
4. Oranye I C, Rf=0,88 (putih)
5. Poncou SX, Rf=0,98 (kemerahan)
 Penjelasan Zat Warna

• Berdasarkan kepolarannya adalah : tartrazin poncou,

oranye I, kuning AB, kuning OB (paling kurang larut
dalam air).

• Fase gerak berupa amoniak 10%, maka tartrazin kurang

larut dalam fase gerak, tetapi mudah larut dalam pelarut
organik. Tartrazin sifat basa lebih kuat, dari pancou
sehingga paling lambat migrasinya dalam suasana basa
(amoniak 10%).

• Bila zat warna tidak discanner, tetapi bercak disari

kemudian diencerkan etanol sampai 5,0 ml. Larutan yang
didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang serapan maksimumnya: 30
30
Analisis Kuantitatif

• Analisis kuantitatif hampir sama dengan

spektrofotometri, penentuan kadar analit dikorelasikan
dengan area bercak pada pelat KLT.

• Cara penetapan kadar dapat dilakukan dengan : 

– Standar tunggal (Membandingkan area bercak analit dengan
area bercak baku pembanding yang diketahui konsentrasinya)
– Kurva kalibrasi (mencari nilai x dari persamaan regresi linear
yang dihasilkan oleh kurva kalibrasi
Standar Tunggal

Membandingkan area bercak analit dengan area bercak

baku pembanding yang diketahui konsentrasinya.
• Cx/Ax = Cp/Ap
• Cx = Ax / Ap x Cp
Cx = konsentrasi analit
Ax = area analit 
Ap = area baku pembanding
Cp = konsentrasi baku pembanding
Kurva kalibrasi

• Kurva kalibrasi dibuat dengan cara memplot area bercak

terhadap konsentrasi dari satu seri larutan baku
pembanding.
• Kurva yang terbentuk harus linear, kemudian dengan
persamaan garis regresi dapat ditentukan kadar analit. 
• Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area
noda plat KLT akan lebih terjamin keakuratannya
dibanding metode KCKT atau KGC, sebab area noda
kromatogram diukur pada posisi diam atau “zig-zag”
menyeluruh.
Analisis Kuantittaif dengan standar Tunggal

• Seorang TTK melakukan analisis kadar kafein di dalam

sediaan kopi dan dibandingkan dengan standar kafein
100 ppm. Setelah dilakukan elusi pada eluen
kloroform:metanol (8:2) diperoleh bercak noda dan
standar kafein kemudian plat discan menggunakan TLC
Scanner. Dari percobaan tersebut diperoleh data
sebagai berikut
Nama sampel Rf Luas Area
Baku kafein 0,65 98,76
Kopi 0,64 45,73

• Berapakah kadar kafein di sampel tersebut?

Diketahui Cp = 100 ppm
Ap = 98,76
Ax = 45,73
Berapa Cx..???

• Cx = Ax / Ap x Cp
• Cx = 45,73/98,76 x 100
• Cx = 46,30 ppm
Contoh soal

• Seorang TTK melakukan analisis kadar paracetamol di

dalam obat oskadon dan dibandingkan dengan standar
paracetamol 5 mg/100 ml. Setelah dilakukan elusi pada
eluen kloroform:etanol (3:7) diperoleh bercak noda dan
standar paracetamol kemudian plat discan
menggunakan TLC Scanner. Dari percobaan tersebut
diperoleh data sebagai berikut
Nama sampel Rf Luas Area
Paracetamol 0,78 988,76
Oskadon 0,77 450,73

• Berapakah kadar parcetamol di sampel tersebut?

 Analisis Kuantitatif
• Analisis kuantitatif diperlukan senyawa baku pembanding, dan dibuat kurva regresi
linier.

• Untuk menguji tetrasiklin yang tidak mengalami degradasi digunakan cara analisis
dengan KLT

• Dibuat kurva baku hubungan kadar (mcg/ml) dan luas puncak (mV).

Data Kadar Luas puncak

• 0,0 mcg 1,96 mV

• 5 mcg 8,5468 mV
• 10 mcg 13,6856 mV
• 15 mcg 19,0454 mV
• 20 mcg 23,9754 mV
• 25 mcg 29,356 mV
• 30 mcg  38,675 mV

53
Kurva regresi liniar normal

Y= 2.396 X + 1.097

38
38
Aplikasi regresi linear
• Persamaan kurva kromatogram yang didapat pada
pengamatan tetrasiklin mempunyai persamaan regresi
linier sebagai berikut:
• Y = 0,513 X + 1,487 , R= 0,9996 
• Contoh menghitung:
Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV,
Maka harga X :
X = (24,487-1,487): 0,513
= (23)x 0,513
=44,834 mcg/ ml

39
Untuk analisis kuantitatif zat warna tidak discanner tetapi
bercak disari kemudian diencerkan etanol, dan
diencerkan sampai 5,0 ml.

Cara penyarian, pemisahan dan pengenceran harus

optimal. Untuk membuat kurva baku diperlukan lempeng
yang besar untuk elusi senyawa baku yang berbeda
kadarnya.

40
Yang perlu Diperhatikan Dalam uji
Kuantitatif

1. Pemisahan antara obat

2. Linearitas kadar yang dapat diuji
3. Ketelitian hasil
4. Ketepatan hasil.
Hasil penelitian Rhodamin
a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)
No Nama Sampel Warna Benang Wol Hasil
Uji
1 Kerupuk bunga Merah muda +
(tersanjung)
2 Kerupuk bawang Tidak merah muda -

3 Kerupuk ketela Merah muda +

4 Kerupuk rengginang Tidak merah muda -
ketan
5 Kerupuk rengginang Tidak merah muda -
beras
6 Kerupuk slondok Tidak merah muda +

7 Kerupuk unyil Merah muda +

8 Kerupuk taro Tidak merah muda -

9 Kerupuk lotek Tidak merah muda -

10 Kerupuk angin Tidak merah muda -

Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan 366 nm

Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nm

a. Kerupuk ketela
b. Kerupuk bunga (tersanjung)

c. Kerupuk unyil
A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml) Luas Area (milivolt)
0,005 0,7092
0,015 0,8493
0,030 0,8582
0,060 2,8790
0,090 3,2248
0,120 4,5278

2. Sampel kerupuk ketela

Replikasi Luas area (milivolt)
1 1,3010
2 1,0251
3 1,1926
4 1,4120
5 1,2412
6 1,0307
7 0,7282
• Persamaan regresi linear
B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt)
0,005 0,4425
0,015 1,1420
0,030 1,5273
0,060 3,0667
0,090 4,2450
0,120 5,1967

2. Sampel kerupuk bunga

Replikasi Luas area (milivolt)

1 2,1328
2 1,7314
3 1,2856
4 1,4730
5 1,0555
6 1,0966
7 0,6985
• Hitung kadar rhodamin yang ada di sampel kerupuk
bunga…??
C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil
1. standar Rhodamin B

Kadar (mg/100ml) Luas area (milivolt)

0,005 0,4865
0,015 0,9649
0,030 1,3910
0,060 1,6812
0,090 2,1991
0,120 2,2197

2. Sampel kerupuk unyil

Replikasi Luas area (milivolt)

1 0,5340
2 0,7687
3 0,5636
4 0,5116
5 0,5502
• Hitung kadar rhodamin yang ada di kerupuk unyil,,,,??
Kesimpulan penggunaan HPTLC
a. HPTLC dapat digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis campuran senyawa antara 20 sampai 30
senyawa.
b. Biaya pemeliharaan, operasinal, jauh lebih murah dari
HPLC.
c. Cara deteksinya bercak(senyawa) pada lempeng lebih
banyak pilihan dari HPLC walaupun dengan pereaksi
warna.
d. Pemisahan yang terjadi pada HPTLC lebih dari 10 menit,
sedangkan HPLC mungkin lima menit sudah selesai.
e. Ketilitian dan ketepatan mendekati HPLC.

51