Validasi metode uji

Aminudin Sulaeman
 Definisi
Validasi adalah proses untuk mebuktikan atau
mengkonfirmasi kinerja karakteristik suatu metode
analisis.

Suatu proses evaluasi kinerja metode dan

menunjukkan bahwa metode tersebut dapat
memenuhi persyaratan tertentu.

Validasi harus dilakukan oleh operator dan peralatan

laboratorium tertentu menggunakan metode pada
rentang konsentrasi yang wajar dengan periode waktu
yang ditentukan.
laboratorium Harus memastikan
metode yang digunakan dalam
pengujian rutin :

a ) Telah divalidasi
b ) Menunjukkan metode yang di
gunakan telah cocok dengan
tujuan, dilakukan dengan benar,
dan bahwa hasil yang diperoleh
dapat diandalkan

Tergantung pada Sumber Metode

 Mengapa metode analisis harus
divalidasi ?
• Untuk meminimalkan kesalahan analisis dan
instrumental
• Untuk memberikan hasil yang dapat diandalkan
dan direproduksi sesuai dengan spesifikasi yang
diberikan dari metode uji
• Untuk menjamin kualitas hasil uji
• Untuk memenuhi kebutuhan akreditasi
• Bukti obyektif untuk pertahanan terhadap
tantangan/sanggahan
• Untuk meyakinkan kebenaran hasil
 Ke
Tingk-tingkat metode yang harus bu
divalidasi Laboratorium tu
• Metode Internasional, Regional atau Standar ha
Nasional (misalnya ISO , Standar Nasional , OM, n
undang-undang )
• Metode yang divalidasi oleh Lembaga Independen val
yang diakui (misalnya AOAC , AFNOR , MicroVal , ida
NordVal - ISO 16140 ) si
• Laboratorium memodifikasi metode Standar /
AOAC / AFNOR / MicroVal dll M
• Metode yang ditentukan oleh pembuat peralatan e
/produsen kit nin
• Metode yang diterbitkan dalam literatur ilmiah g
• Metode yang dikembangkan oleh laboratorium kat
 Kapan metode uji tidak perlu
divalidasi ?

Metode standar yang digunkan pada

kondisi :
- diterapkan sesuai dengan lingkupnya
(misalnya matriks, kisaran, dll)
- Tanpa modifikasi (termasuk rencana QA
dan pelaporan)

Jika tidak, maka harus divalidasi

 Tanyakan pada diri sendiri
Analit apa yang harus ditentukan/dideteksi?
berapa tingkat konsentrasi yang diharapkan?
bagaimana matriks sampelnya?
Apakah ada kontamisaindari zat yang tidak diharapkan, jika demikian, ada
maka harus dideteksi dan diukur?
Apakah ada persyaratan legislatif atau peraturan tertentu?
Apakah informasi berupa kualitatif atau kuantitatif?
Berapa batas deteksi dan kuantitasi yang diperlukan?
Berapa kisaran konsentrasi yang diharapkan?
Berapa tingkat presisi dan akurasi diharapkan?
Bagaimana ketangguhan metode tersebut?
Jenis peralatan apa yang harus digunakan? apakah metode dikhususkan untuk
untuk satu instrumen tertentu, atau dapat digunakan oleh semua instrumen
dari jenis yang sama?
Apakah metode hanya digunakan dalam satu laboratorium tertentu atau
harus itu berlaku di semua laboratorium di wilayah atau di seluruh dunia?
Keterampilan apa yang harus dimiliki pengguna metode tersebut?

Sebelum anda melakukan valkidasi metode

Berapa Banyak Data Diperlukan?

• Kualitas dan kuantitasnya

cukup untuk memberikan
kepercayaan tentang kinerja
metode dan dapat memenuhi
persyaratan lab / klien
Dipengaruhi oleh:
• Sumber/Status metode
• Alasan klien tentang
kebutuhan pengujian
• Rentang sampel yang diuji
secara rutin
• Persyaratan Badan Akreditasi
Nasional
 Parameter untuk Validasi
Ketepatan ( accuracy)
ketelitian ( precision)
kekhususan (Specifity)
Batas deteksi ( limit of Detection)
Batas kuantitasi (limit of Quatitation)
Linearitas dan rentang ( linearity and range)
kekasaran (ruggedness)
kesegaran(robustnees)
 Strategi Validasi Metode
1. Mengembangkan protokol validasi, prosedur operasi
atau rencana pokok validasi.
2. Untuk proyek validasi spesifik menentukan pemilik
dan tanggung jawab.
3. Mengembangkan rencana proyek validasi.
4. Mendefinisikan aplikasi, tujuan dan ruang lingkup
metode.
5. Menentukan parameter kinerja dan kriteria
penerimaan.
6.Tentukan percobaan validasi.

Source: LabCompliance (2007). Validation of Analytical Methods and Procedures:

Tutorial. http://www.labcompliance.com/tutorial/methods/default.aspx?sm=d_d
 Strategi Validasi Metode
7. Verifikasi karakteristik kinerja yang relevan peralatan.
8. Memenuhi syarat bahan, misalnya standar dan reagen untuk
kemurnian, jumlah akurat dan stabilitas yang cukup.
9. Lakukan percobaan pra-validasi.
Sesuaikan parameter metode atau / dan kriteria penerimaan jika
diperlukan.
10. Lakukan internal dan (eksternal) percobaan untuk validasi
penuh.
11. Kembangkan protokol operasional standar (SOP) untuk
melaksanakan metode dalam rutinitas.
12. Tentukan kriteria untuk validasi ulang.
13. Menentukan jenis dan frekuensi tes kesesuaian sistem dan /
atau kontrol kualitas analitis (AQC) pemeriksaan rutin.
14. Dokumentasikan semua percobaan validasi dan hasil dalam
laporan validasi.
 Strategi validasi metode
Major Major Traces Traces
compounds compounds
quantitative qualitative quantitative qualitative

Limit of × × × √
detection

Limit of √ × √ ×
quantitation

Linearity √ √ √ ×

Range √ √ × ×

Precision √ √ √ ×

Accuracy √ √ √ ×

Specificity √ √ √ √

Ruggedness √ √ √ ×
 Peralatan validasi metode
Kertas grafik
dapat digunakan dengan data dari percobaan linearitas untuk
menilai berbagai dilaporkan dari metode.
menyediakan sebidang rata-rata dari kelompok hasil tes
ulangan pada y-axis versus nilai yang diberikan (dalam% atau
konsentrasi unit) pada sumbu x.

SD Kalkulator

Laptop/komputer dengan program Excell

 Peralatan validasi metode

Pasangan-data yang Kalkulator

dapat digunakan dengan data dari perbandingan metode
eksperimen untuk menghitung statistik regresi linear
(kemiringan, y-intercept, dan standar deviasi sekitar garis
regresi, y/ x ), dan koefisien korelasi (r, Pearson product
moment koefisien korelasi); statistik t-test (rata perbedaan
antara dua metode atau bias mean; SD diff, standar deviasi
dari perbedaan antara dua metode).
Dapat juga digunakan untuk memberikan “plot
perbandingan " yang menunjukkan hasil pengujian metode
pada sumbu y terhadap hasil metode komparatif pada
sumbu x, serta "perbedaan plot" yang menampilkan
perbedaan antara pengujian dikurangi hasil pembanding
pada sumbu y terhadap hasil metode pembanding pada
sumbu x.
 Sampling

Preparasi sampel

Analisis

Kalibrasi

Evaluasi data
Pelaporan
Sampling

• Analisis dimulai dengan pengambilan

sampel
• Untuk analisis jejak: sampel menjadi
sumber utama kesalahan
• Berbeda dari matriks ke matriks
 Metode sampling
• Kapan, dimana dan bagaimana cara mengumpulkan
sampel
• Transportasi sampel ke laboratorium
• Peralatan Sampling
• wadah sampel
• Prosedur pengelolaan sampel (pengeringan,
pencampuran, dll sebelum pengukuran)
• Prosedur sub-sampling
• Penyimpanan selama pengambilan sampel
Metode Sampling
Untuk mendapatkan sampel yang
representatif
Jenis sampel
mobil atau bin pengambilan sampel
stratified sampling
random sampling
2 langkah pengambilan sampel
Sampling Interval
Masalah selama sampling dan penyimpanan
sampel
Kerugian dari penguapan
Dekomposisi dengan cara:
suhu
radiasi UV
aktivitas mikroba
reaksi kimia dengan oksigen, wadah sampel, dll
 Accuracy
Untuk menentukan kedekatan hasil uji
yang diperoleh dengan nilai
sebenarnya dari standar yang
digunakan

Untuk mengukur adanya kesalahan

sistemik analisis
Accuracy
Metode yang digunakan:
• Menggunakan bahan standar dari pemasok
dengan toleransi yang diketahui
(bersertifikat) atau standar yang
direkomendasikan oleh metode referensi
tertentu.
• Standar kerja dapat digunakan sebagai
tambahan standar (analisis spike).
• Melakukan lebih dari 2 penentuan pada
konsentrasi rendah, menengah dan tinggi.
 Accuracy
Metode yang digunakan:
Untuk metode menggunakan instrumen, buat kurva
kalibrasi standar yang standar yang diketahui,
penentuan pada rentang yang sesuai.
Untuk metode tanpa batas, kisaran dapat dipilih dari
pengetahuan rentang konsentrasi sampel yang
dianalisis.
Berdasarkan hasil yang diperoleh, hitung nilai rata-
rata standar yang diperoleh dan bandingkan dengan
nilai yang direkomendasikan atau
Bandingkan hasil yang diperoleh dengan bahan
referensi bersertifikat (CRM).
Accuracy
Table 1: Acceptable Recovery Percentages
Analyte (%) Unit Mean Recovery (%)
100 100% 98-102
10 10% 98-102
1 1% 97-103
0.1 0.1% 95-105
0.01 100 ppm 90-107
0.001 10 ppm 80-110
0.0001 1 ppm 80-110
0.00001 100 ppb 80-110
0.000001 10 ppb 60-115
0.0000001 1 ppb 40-120

Source: AOAC (2002). AOAC Requirements for Single Laboratory Validation of Chemical
Methods. DRAFT 2002-11-07, \AOACI\eCam\Single-Lab_Validation_47.doc.
http://www.aoac.org/Ag_Materials/additives/aoac_slv.pdf.
 Presisi
Untuk menentukan tingkat kesepakatan hasil uji
untuk sampel tertentu.
Presisi digunakan untuk mengukur adanya
kesalahan acak analisis.
3 jenis pengukuran presisi
(1) Presisi pengulangan oleh (satu operator tunggal,
dalam laboratorium yang sama, dalam rentang
waktu yang singkat)
(2) presisi Intermediate (reproducibility intern:
antara operator, laboratorium tunggal)
(3) (uji profisiensi / studi kolaboratif antar
laboratorium) Reproducibility
 Presisi
Pengulangan (satu operator tunggal, laboratorium tunggal,
rentang waktu yang singkat).
Mengacu pada tingkat kesepakatan dari hasil ketika kondisi
dipertahankan sekonstan mungkin.
Pilih satu sampel untuk setiap matriks dan melakukan replikasi
untuk setiap matriks dalam hari yang sama.
Jika sumber daya memungkinkan, jalankan sampel yang sama
selama 3 hari yang berbeda (dalam kurun waktu 7 hari).
Hitung standar deviasi (SD) dan relatif standar deviasi (RSD)
untuk setiap matriks.
Bandingkan hasil presisi dengan RSD% pada Tabel 2.
 Presisi
Presisi intermediate (reproducibility internal: antar
operator, dalam laboratorium yang sama).
Untuk mengevaluasi tingkat kesepakatan antar operator
yang berbeda untuk sampel yang sama.
Mengukur kesalahan acak yang melekat ketika analis yang
berbeda melakukan analisis yang sama terhadap sampel
yang sama.
Gunakan uji-F untuk menentukan apakah ada perbedaan
yang signifikan dalam hasil antara presisi antara dua
operator.
Hitung varians sampel untuk masing-masing operator.
Hitung presisi untuk setiap operator sesuai dengan jenis
sampel dan bandingkan dengan nilai (%) RSD.
Precision

Table 1: Acceptable Recovery Percentages

Analyte (%) Unit RSDr (%) RSDR (%)

100 100% 1 2
10 10% 1.5 3
1 1% 2 4
0.1 0.1% 3 6
0.01 100 ppm 4 8
0.001 10 ppm (μg/g) 6 11
0.0001 1 ppm 8 16
0.000001 10 ppb (μg/kg) 15 32

AOAC (2002). AOAC Requirements for Single Laboratory Validation of Chemical Methods.
DRAFT 2002-11-07, \AOACI\eCam\Single-Lab_Validation_47.doc.
http://www.aoac.org/Ag_Materials/additives/aoac_slv.pdf.
 Presisi

Nilai RSD% dapat dihitung dari rumus HORRAT:

RSDr = C-0,15 (pengulangan)
RSDR = 2C-0,15 (Reproducibility)

HORRAT = RSD (ditemukan) / RSD (dihitung)

Nilai yang dapat diterima untuk rasio ini biasanya
0,5-2.
 Limit Deteksi
Limit deteksi adalah jumlah terkecil atau konsentrasi suatu analit
yang dapat ditentukan dengan keandalan yang dapat diterima.
Definisi alternatif dari limit deteksi dan limit penentuan
berdasarkan variabilitas blangko.
Nilai rata-rata blanko ditambah tiga kali standar deviasi blanko
diambil sebagai limit deteksi dan nilai rata-rata blanko ditambah
10 kali standar deviasi blanko diambil sebagai batas penentuan.
Limit deteksi hanya berguna untuk mengontrol impuritis yang
tidak diinginkan yang ditetapkan sebagai "tidak lebih dari" tingkat
rendah yang ditentukan dan untuk kontaminan tingkat rendah.
Limit deteksi dan tekad yang perlu untuk spesifikasi komposisi
meskipun masalah statistik apakah limit telah dilampoi.
 Limit deteksi intrumen
Untuk menentukan konsentrasi terendah analit dalam
sampel yang dapat dideteksi.
Hal ini penting untuk analisis jejak.
Melakukan beberapa penentuan dan menghitung SD
dari blanko
LOD = x + 3 SD (x = rata membaca kosong) atau
Melakukan beberapa penentuan pada konsentrasi
terendah yang dapat diterima menggunakan sampel
standar (yang diperkaya sampel blanko) dan
menghitung SD.
LOD = x + 3 SD (x = rata-rata sampel membaca kosong)
 Limit deteksi metode
Hal ini didasarkan pada sampel yang telah melalui
seluruh persiapan sampel sebelum analisis.
Batas deteksi metode adalah batas deteksi sekitar 4 ×
instrumen.
Lakukan beberapa penentuan pada konsentrasi-
konsentrasi kisaran rendah, menengah dan tinggi
menggunakan sampel.
Hitung SD di kisaran konsentrasi.
Plot SD terhadap konsentrasi analit.
Ekstrapolasi grafik sampai y-axis tercapai.
Pada konsentrasi nol, merekam sd 0.
Limit deteksimetode = 3 sd0
Ini adalah unik untuk sampel matriks tertentu.
 Signal to Noise Ratio

Source: LabCompliance (2007). Validation of Analytical Methods and Procedures:

Tutorial. http://www.labcompliance.com/tutorial/methods/default.aspx?sm=d_d
Source: International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements
for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical
procedures: Methodology, adopted in 1996, Geneva
 Spesifitas/selektivitas
Hal ini didasarkan pada sampel yang telah melalui seluruh
persiapan sampel sebelum analisis.
Batas deteksi metode adalah sekitar 4 × batas deteksi instrumen.
Lakukan beberapa penentuan pada masing-masing konsentrasi
kisaran rendah, menengah dan tinggi menggunakan sampel.
Hitung SD di setiap kisaran konsentasi.
Plot SD terhadap konsentrasi analit.
Ekstrapolasi grafik sampai y-axis tercapai.
Pada konsentrasi nol, merekam sd0.
Limit metode deteksi = 3 sd0
Ini adalah berrlaku untuk matriks sampel tetentu.
 Examples of pure and impure HPLC peaks

Source: LabCompliance (2007). Validation of Analytical Methods and Procedures:

Tutorial. http://www.labcompliance.com/tutorial/methods/default.aspx?sm=d_d
 Linieritas
Untuk menentukan tingkat variansi dari kurva kalibrasi
Lakukan beberapa penentuan menggunakan sampel
standar pada jangkaua rendah, menengah dan tinggi .
Hitung SD masing-masing kelompok konsentrasi.
Hitung garis paling sesuaI dari kurva kalibrasi dan
koefisien korelasi (r2) dari kurva.
Gunakan F-test untuk menentukan perbedaan yang
signifikan dalam varians dari kurva untuk setiap
kelompok konsentrasi.
 Rouggness/Kekasaran
• Kekasaran didefinisikan oleh US Pharmacopea
sebagai tingkat reproduksi dari hasil yang
diperoleh di bawah berbagai kondisi laboratorium
yang berbeda, seperti analis, instrumen, kondisi
lingkungan, operator dan bahan.
• Kekasaran adalah ukuran reproduktifitas hasil tes
di bawah normal, diharapkan kondisi operasional
dari laboratorium ke laboratorium dan dari analis
analis.
• Kekasaran ditentukan oleh analisis, homogenitas
dari dalam aliquot laboratorium yang berbeda.
Lihat contoh "ketidakrataan Percobaan" di AOAC.
 Robuthness /Ketahanan
• Ketahanan menguji parameter di bawah pengaruh variabilitas
operasional pengujian terhadap hasil analisis.
• Parameter ini adalah pH, laju alir, temperatur kolom, Volume
injeksi, panjang gelombang deteksi atau komposisi fasa gerak.
• Jika pengaruh parameter berada dalam toleransi yang
ditentukan, maka dikatakan bahwa parameter berada dalam
jangkauan ketahanan metode ini.
• Data yang diperoleh dari efek ini membantu untuk menilai
apakah metode harus divalidasi ulang ketika satu atau lebih
parameter yang berubah, misalnya, untuk melihat kinerja
kolom dari waktu ke waktu.
• Disarankan untuk mengevaluasi ketahanan metode ini pada
tahap pengembangan metode, dan apapun hasil nya harus
didokumentasikan.
Pentingnya Mengkonfirmasi Hasil
- Apakah hasil positif “benar positif "?
- Apakah hasil negatif "benar negatif "?
Contoh bila diperlukan:
- Isolat dari sampel yang terkontaminasi
secara alami, di mana
konfirmasi tidak secara rutin diperlukan
dengan metode.
- Jika metode yang diverifikasi adalah
"Novel" test konfirmasi
- Jika hasil berdasarkan pertumbuhan
pada media selektif mana
Metode ini tidak memerlukan
konfirmasi lebih lanjut
Kriteria Untuk Menilai Hasil dan Kinerja
Metode

• Idealnyadipertimbangkan sebelum verifikasi ...

tapi biasanya didefinisikan setelah pekerjaan
yang dilakukan sesuai data yang diperoleh!

• Gunakan mikrobiologi keahlian / insting Anda

untuk menilai data ... jika terlihat baik maka
mungkin baik ... hanya perlu mendefinisikan
secara teknis apa yang Anda maksud dengan
"baik" !!
Kriteria teknis Untuk Menilai Hasil dan Kinerja
Metode
• Sebaiknya tidak terlalu memasalahkan adanya
perbedaan, tetapi harus menetapkan perbedaan
maksimum yang dapat diterima antara hasil yang
diperoleh dengan "hasil benar", namun "true value"
harus didefinisikan.
• Harus menetapkan kriteria dalam hal signifikansi
statistik
- suatu perbedaan mungkin signifikan secara statistik, tetapi
begitu kecil untuk menjadi tidak praktis / relevansi dalam
kaitannya dengan penggunaan metode.
-jika jumlah data atau analisis memadai Suatu perbedaan yang
substansial bisa saja secara statistik tidak.
 Faktor-faktor yang perlu
dipertimbangkan dalam menilai hasil.

• Hindari melihat hanya pada rata-rata hasil, dapat

lebih baik juga untuk melihat perbedaan individu
• Pertimbangkan bagaimana hasil yang diperoleh
masuk dalam penilaian
• Pastikan pendekatan yang digunakan untuk
menilai hasil yang valid (misalnya pasangan data;
Un dipasangkan data; koefisien regresi Regresi;
Selisih nilai log;% kontrol positif / negatif; batas
deteksi; Bias Maksimum)
 Mendokumentasikan Metode Verifikasi
• Alasan untuk bekerja
• literatur yang Mendukung / data yang diterbitkan / status
persetujuan
• Cara verifikasi (dan rincian metode referensi / pembanding, di
mana berlaku)
• Kriteria untuk menilai hasil dan menerima metode untuk
digunakan
• Pendekatan Eksperimental digunakan
• matriks sampel yang digunakan
• Organisme dan sumber / asal
• tingkat Spike
• Data / Hasil
• Analisis data (menjelaskan / membenarkan data dikecualikan
dari penilaian)
• Pernyataan ulang metode kesesuaian untuk digunakan
 Sources
• ISTA guide:
http://www.seedtest.org/upload/cms/user/130_p22.pdf

• EURACHEM guide:
http://www.farmacia.ufmg.br/lato/eurachem%20guide%
20validation%20(1).pdf

• AOAC guide:
http://www.aoac.org/Ag_Materials/additives/aoac_slv.pd
f

• Other guide:
http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-
Others/Laboratory/f-505-method-validation-draft.pdf