DETERMINATION OF BENZO SOP-Q&A-0-016

(a) PYRENE IN OIL & FAT BY HPLC

Prepared by, Approved by, Dept

Section
Revision
Eff. Date
Head of Dept. GM/DGM Page

1 Ruang Lingkup

Metode ini dapat diaplikasikan untuk penentuan kadar Benzo (a) Pyrene dalam minyak /lemak yang
minyak/lemak yang mentah atau sudah dirafinasi.

2 Instrument yang Digunakan

HPLC SHIMADZU yang terdiri dari :
2.1 Degasser DGU - 12A
2.2 2 unit Pompa LC 10ADVP
2.3 Kolom Supercosil LC-PAH 5 mikron
2.4 Detektor RF-10AXL
2.5 Kontroller SCL-10ADVP
2.6 Komputer

3 Alat Yang Digunakan

3.1 Timbangan Digital dengan ketelitian min 0.0001 gr
3.2 Labu takar 10 ml, 25 ml dan 100 ml
3.3 Pipet Volume 1 ml dan 2 ml
3.4 Syringe 100 mikroliter
3.5 Gelas ukur 50 ml
3.6 Bottom flask 100 ml
3.7 Rotaryvapor
3.8 Vial 5 ml
3.9 Pompa Vaccum
3.10 Labu Vaccum Buchner
3.11 Corong Penyaring Whatman
3.12 Ultrasonic Cleaner
3.13 Botol untuk Eluent

4 Bahan Yang Digunakan

4.1 Aluminium Oxide
4.2 Natrium Sulfat Anhidrat
4.3 Petroleum Ether 40-60 or equivalence
4.4 Toluene
4.5 Acetonitril
4.6 Aquadest
4.7 Benzo (a) Pyrene ( BaP ) murni
4.8 Whatman Cellulose Nitrat Filter 0.45 Mikron
4.9 Whatman PTFE Filter 0.5 Mikron
4.10 Whatman PTFE Filter 0.2 Mikron

5 Pembuatan larutan Standard Benzo ( a ) Pyrene

5.1 Larutan Induk BaP 500 ppm
Timbang 12.5 mg Benzo a pyrene standard (BaP), dengan ketelitian 0.1 mg dalam labu
takar 25 ml. Kemudian larutkan dengan toluena hingga garis tanda.
Simpan dalam wadah gelap dan masukkan dalam refrigerator pada temperature 8 0C, ( tahan
selama 6 bulan )

5.2 Larutan Standard BaP 10 ppb

Pipet 2 mikroliter larutan induk BaP 500 ppm, pindahkan dalam labu takar 100 ml, kemudian encerkan
dengan acetonitril hingga garis tanda.

DETERMINATION OF BENZO SOP-Q&A-0-016

(a) PYRENE IN OIL & FAT BY HPLC
 5.3 Larutan Standard BaP 0.4 ppb
Pipet 1 ml larutan Standard BaP 10 ppb dan masukkan dalam labu takar 25 ml, kemudian encerkan
dengan acetonitril hingga garis tanda.

5.4 Larutan Standard BaP 0.8 ppb

Pipet 2 ml larutan BaP 10 ppb, dan masukkan dalam labu takar 25 ml, kemudian encerkan
dengan acetonitril hingga garis tanda.

5.5 Larutan Standard BaP 1.2 ppb

Pipet 3 ml larutan Standard BaP 10 ppb, dan masukkan dalam labu takar 25 ml, kemudian encerkan
dengan acetonitril hingga garis tanda.

5.6 Larutan Standard BaP 1.6 ppb

Pipet 4 ml larutan Standard BaP 10 ppb dan masukkan dalam labu takar 25 ml, kemudian encerkan
dengan acetonitril hingga garis tanda.

5.7 Larutan Standard BaP 2.0 ppb

Pipet 5 ml larutan Standard BaP 10 ppb dan masukkan dalam labu takar 25 ml, kemudian encerkan
dengan acetonitril hingga garis tanda.

5.8 Larutan Standard BaP 5.0 ppb

Pipet 12.5 ml larutan Standard BaP 10 ppb dan masukkan dalam labu takar 25 ml, kemudian encerkan
dengan acetonitril hingga garis tanda.

Saring semua larutan standard denga Whatman PTFE filter 0.2 mikron sebelum diinjeksikan, dan
lakukan injeksi Standard 2 kali ( minimal 60 mikro liter ) untuk setiap standard.

6 Preparasi Sampel
6.1 Timbang 5 g sampel (jika padat, cairkan terlebih dahulu) dengan ketelitian mendekati mendekati 1 mg
dalam labu takar 10 ml. Kemudian larutkan dengan n-Hexan (p.a) hingga garis tanda dan kocok hingga
homogen ( catat berat sampel = BS ).
6.2 Isi kolom pisah hingga setengah bagian dengan petrolium ether. Timbang 22 g aluminium oxide,
dan pindahkan kedalam kolom pisah. Lalu tambahkan natrium sulfat anhidrat hingga
tingginya lebih kurang 3 cm dalam kolom.
6.3 Pipet 2 ml larutan sampel dan masukkan kedalam kolom pisah, bilas menggunakan petrolium ether,
tampung eluat yang keluar dengan menggunakan gelas ukur hingga diperoleh 20 ml eluat.
6.4 Pindahkan secara kuantitatif kedalam bottom flask 100 ml dan penuhkan dengan
petrolium ether hingga diperoleh 100 ml larutan.
6.5 Uapkan larutan dengan menggunakan rotaryvapor hingga kering, kemudian bilas dengan
1 - 2 ml petrolium ether dan pindahkan kedalam Vial 5 ml yang telah diketahui bobotnya, keringkan
dengan menggunakan gas nitrogen.

6.6 Larutkan Sampel dengan menggunakan Acetonitril dan pindahkan secara kuantitatif kedalam labu
takar 25 ml, lalu cukupkan dengan Acetonitril hingga garis tanda.
6.7 Saring sampel dengan menggunakan Whatman PTFE Filter 0.2 miron, hingga diperoleh larutan
tidak kutang dari 5 ml larutan.
6.8 Injeksikan kedalam HPLC Instrument dengan volume tidak kurang dari 60 ml lakukan injeksi
sampel sebanyak 2 kali.
6.9 lakukan Injeksi blanko dengan 100 ml Petrolium Ether (mengikuti point 6.5 sampai 6.8)
saring sample blanko yang akan diinjeksi dengan whatman PTFE filter 0.2 Mikron lakukan
injeksi 2 X untuk blanko.

DETERMINATION OF BENZO SOP-Q&A-0-016

(a) PYRENE IN OIL & FAT BY HPLC
7 PREPARASI ELUENT
7.1 UNTUK ELUENT YANG NON GRADIENT GRADE MAKA ELUENT HARUS DISARING SEBELUM
DIGUNAKAN.
7.2 GUNAKAN WHATMAN CELLULOSE NITRAT FILTER 0.45 MIKRON UNTUK MENYARING ELUENT
ANORGANIK
GUNAKAN WHATMAN PTFE FILTER 0.5 MIKRON UNTUK MENYARING ELUENT ORGANIK.
7.3 SEBELUM ELUENT DIGUNAKAN MAKA SEBAIKNYA ELUENT DIULTRASONIC UNTUK
MENGHILANGKAN GELEMBUNG ATAU JIKA TIDAK ELUENT DIDIAMKAN SEDIKITNYA 0.5 JAM
SEBELUM DIGUNAKAN.
ISILAH PENUH ELUENT PADA BOTOL ELUENT SAAT MULAI OPERASI UNTUK MENGHINDARI
PENGISIAN ULANG YANG DAPAT MENIMBULKAN GELEMBUNG.

8 MENGHIDUPKAN INSTRUMENT

HIDUPKAN INSTRUMEN DENGAN LANGKAH LANGKAH SBB :

8.1 HIDUPKAN DEGASSER DGU-12A
LAMPU HIJAU DAN LAMPU MERAH AKAN MENYALA KEMUDIAN SETELAH BEBERAPA SAAT
LAMPU MERAH AKAN MATI ( JIKA TIDAK BERARTI ADA KERUSAKAN )
MERAH AKAN MATI ( JIKA TIDAK BERARTI ADA KERUSAKAN )
8.2 HIDUPKAN POMPA A DAN POMPA B LC-10ADVP
TIDAK PERLU PENYETELAN PADA POMPA A DAN B
8.3 HIDUPKAN DETEKTOR RF-10AXL
TIDAK PERLU PENYETELAN PADA DETEKTOR
8.4 HIDUPKAN CONTROLLER SCL-10AVP
TIDAK PERLU PENYETELAN PADA CONTROLLER
8.5 HIDUPKAN KOMPUTER

9 KONFIGURASI INSTRUMENT

SETELAH SEMUA UNIT HIDUP MAKA LANGKAH PERTAMA ADALAH MELAKUKAN

KONFIGURASI UNTUK MENGINFORMASIKAN KE CONTROLLER UNIT YANG AKAN
BEKERJA DGN LANGKAH SBB :

9.1 2X KLIK CLASS VP

9.2 2X KLIK INSTRUMENT 1
9.3 KLIK FILE
9.4 KLIK CONFIGURE
9.5 KLIK CONFIGURE
9.6 KLIK AUTOCONFIGURATION
9.7 KLIK AUTO CONFIG
9.8 2X KLIK PUMP A
9.9 KLIK PUMP MODEL
9.10 KLIK OK
9.11 KLIK OK
9.12 2X KLIK PUMP B
9.13 KLIK PUMP MODEL
9.14 KLIK OK
9.15 KLIK OK
9.16 2X KLIK DETECTOR
9.17 KLIK DETECTOR MODEL
9.18 KLIK OK
9.19 KLIK OK
9.20 KLIK OK

DETERMINATION OF BENZO SOP-Q&A-0-016

(a) PYRENE IN OIL & FAT BY HPLC

10 PROSEDUR ANALISA BENZO.A.PYRENE

SETELAH INSTRUMENT DIKONFIGURASI MAKA UNTUK ANALISA STANDARD / SAMPEL DAPAT
DILAKUKAN DENGAN CARA SBB :
 10.1 KLIK FILE
10.2 KLIK METHOD
10.3 KLIK OPEN
10.4 KLIK BENZO(A)PYRENE.MET
10.5 KLIK OPEN
10.6 KLIK CONTROL
10.7 KLIK DOWN LOAD METHOD
10.8 KLIK INSTRUMENT ON/OFF UNTUK MENJALANKAN POMPA
PERHATIKAN PARAMETER YANG DITUNJUKKAN OLEH PANEL POMPA A DAN POMPA B
POMPA A AKAN TERTERA 0.12 ML/MENIT
POMPA B AKAN TERTERA 0.88 ML/MENIT
TEKANAN POMPA A&B DIPERHATIKAN .JIKA TEKANAN SEMAKIN MENINGGI BERARTI ADA
BAGIAN YANG SUMBAT DAN SEGERA MATIKAN POMPA UTK PERBAIKAN
10.9 KLIK CONTROL
10.10 KLIK PREVIEW RUN UNTUK MENAMPILKAN KONDISI ANALISA
10.11 KLIK REZERO
BIARKAN ALAT STABIL SELAMA 0.5 JAM
10.12 KLIK THRESHOLD LALU BLOK KIRI DAN KANAN PEAK UTK MENGETAHUI BASE LINE
UNTUK INJEKSI STANDARD / SAMPEL NILAI THRESHOLD HARUS DIBAWAH 1000
JIKA NILAI THRESHOLD TELAH TERCAPAI MAKA LANJUTKAN DENGAN
10.13 KLIK STOP RUN
10.14 KLIK SINGLE RUN
10.15 ISI NAMA SAMPEL
PENGISIAN DATA HARUS MASUK DATA FILE ( JANGAN DI CLASS VP )
10.16 KLIK OK
10.17 TUNGGU SAMPAI MUNCUL TULISAN WAITING FOR TRIGGER
10.18 PUTAR INJECTION PORT KE POSISI LOAD
10.19 INJEKSI SAMPLE KEMUDIAN PUTAR INJECTION PORT KE POSISI INJECT LALU SYRINGE DICABUT.
( SEBELUMNYA PASTIKAN SAMPLE YANG DIINJEKSI TIDAK MEMILIKI GELEMBUNG )
BIARKAN ANALISA BERJALAN SAMPAI SELESAI KEMUDIAN BACA LUAS AREA DGN CARA
10.20 KLIK REPORT
10.21 KLIK VIEW
10.22 KLIK EXTERNAL STANDARD
10.23 KLIK KANAN LALU PRINT ( JIKA MAU DIPRINT )
JADI DAPAT DISIMPULKAN BAHWA PARAMETER UNTUK ANALISA BENZO.A.PYRENE ADALAH
ELUENT AQUADEST : 0.12 %
ELUENT ACETONITRIL : 0.88 %
FLOW RATE : 1 ML/MENIT
EMISI PADA DETEKTOR RF-10AXL : 406 NM
EXITASI PADA DETEKTOR RF-10AXL: 384 NM

11 PERAWATAN KOLOM
SETELAH SELESAI ANALISA MAKA KOLOM HARUS DIJENUHKAN KEMBALI
DENGAN ACETONITRIL : AIR = 60 : 40 ( STANDARD KOLOM DARI PABRIK )

11.1 KLIK INSTRUMENT ON/OFF UNTUK MENGHENTIKAN POMPA

11.2 KLIK FILE
11.3 KLIK METHOD
11.4 KLIK OPEN
11.5 KLIK FLUSH.MET
11.6 KLIK OPEN
11.7 KLIK CONTOL
11.8 KLIK DOWN LOAD METHOD

DETERMINATION OF BENZO SOP-Q&A-0-016

(a) PYRENE IN OIL & FAT BY HPLC

11.9 KLIK INSTRUMEN ON / OFF UNTUK MENGHIDUPAN POMPA

PERHATIKAN PARAMETER YANG DITUNJUKKAN OLEH PANEL POMPA A DAN POMPA B
POMPA A AKAN TERTERA 0.40 ML/MENIT
POMPA B AKAN TERTERA 0.60 ML/MENIT
SAAT FLUSHING TEKANAN AKAN LEBIH TINGGI KARENA DOSING AIR LEBIH BANYAK
( VISCOSITAS AIR LEBIH TINGGI )
 BIARKAN POMPA BEKERJA SELAMA 15 - 20 MENIT

12 PROSEDUR MEMATIKAN HPLC

SETELAH SELESAI MENJENUHKAN KOLOM MAKA LANGKAH BERIKUT ADALAH MEMATIKAN
INSTRUMENT DENGAN LANGKAH SBB :

12.1 KLIK INSTRUMENT ON/OFF UNTUK MEMATIKAN POMPA A & B

12.2 KLIK EXIT
12.3 KLIK EXIT
12.4 KLIK YES
12.5 KLIK START
12.6 KLIK SHUT DOWN
12.7 KLIK OK
12.8 MATIKAN KOMPUTER
12.9 MATIKAN CONTROLLER SCL -10AVP
13.10 MATIKAN DETECTOR RF-10AXL
13.11 MATIKAN POMPA B LC -10ADVP
13.12 MATIKAN POMPA A LC-10ADVP
13.13 MATIKAN DEGASSER DGU-12A

12 PERHITUNGAN KADAR BENZO.A.PYRENE

KONSENTRASI BAP ( PPB ) = Y - B X 250

A 2 X BS

DIMANA :

Y = LUAS AREA
A = INTERSEP YANG DIPEROLEH DARI PERHITUNGAN STANDARD
B = SLOPE YANG DIPROLEH DARI PERHITUNGAN STANDARD
BS = BERAT SAMPEL