Ftc-67.01 Aflatoxin b1 Elisa

PT.
CHAROEN POKPHAND INDONESIA

FEED TECHNOLOGY DIVISION
REGIONAL LABORATORY
FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

1/9 METODE ELISA Tanggal : Januari 2021
1. Ruang Lingkup
Pakan dan bahan pakan asal nabati.
2. Acuan
5.2.1 Romer Labs Division Holding GmbH. (2019). AgraQuant® Aflatoxin B1
2/50 ELISA kit.
5.2.2 R-Biopharm AG. (2008). Ridascreen® Aflatoxin B1 30/15 (Art. No. R1211).
3. Definisi
5.2.1 Aflatoxin B1 adalah zat beracun dan bersifat karsinogenik yang
dihasilkan oleh jamur Aspergillus flavus dan Aspergillus parasiticus.
5.2.2 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) adalah metode pengujian
yang melibatkan enzim dan antibodi, melalui reaksi enzimatik yang
langsung bereaksi secara proposional untuk menentukan konsentrasi
toksin.
5.2.3 Antibody coated microwell adalah microwell yang sudah dilapisi dengan
antibodi.
5.2.4 Non-coated dilution microwell atau mixing well adalah microwell yang
tidak dilapisi dengan antibodi.
4. Prinsip
Prinsip penetapan aflatoxin B1 dengan kit AgraQuant adalah direct
competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Prinsip penetapan aflatoxin B1 dengan kit Ridascreen adalah competitive
enzyme immunoassay.
Aflatoxin B1 diekstraksi dari contoh uji dengan menggunakan larutan
methanol 70%. Hasil ekstraksi dan standar dicampurkan dengan enzim
conjugate Aflatoxin B1, sehingga terjadi kompetisi untuk membentuk
ikatan antibodi Kelebihan conjugate lalu dibuang pada saat pembilasan.
Antibody coated microwell kemudian diinkubasi dengan larutan subtrat.
Penambahan stop solution dimaksudkan untuk menghentikan proses
pengikatan enzim dan mengubah warna larutan.
Microwell diukur secara optik menggunakan microwell reader dengan
panjang gelombang 450 nm (Ridascreen) dan 450 nm dengan referensi
630 nm (Romer).
5. Prosedur
5.1. Alat
5.2.1 Timbangan analitis kepekaan 0.0001 g.
5.2.2 Microwell reader, dengan filter panjang gelombang 450 nm dan 630 nm
atau spectrophotometer dengan microplate.
5.2.3 Multistirrer atau shaking waterbath.
5.2.4 Micropipette multichannel kapasitas 250 µL.
PT. CHAROEN POKPHAND INDONESIA
REGIONAL LABORATORY

5.2.5 Micropipette single channel kapasitas 100 µL.

5.2.6 Pipette tips 100 µL dan 250 µL.
5.2.7 Reagent boat.
5.2.8 Timer.
5.2.9 Microwell holder.
5.2.10 Beaker glass 100 mL.
5.2.11 Erlenmeyer screw 100 mL.
5.2.12 Gelas ukur 100 mL atau dispenser kapasitas 50 mL.
5.2.13 Gleas ukur 1000 mL.
5.2.14 Vial glass atau botol bertutup 8 mL atau centrifuge tube screw 50 mL.
5.2.15 Labu ukur 1000 mL.
5.2. Bahan
5.2.1 Kertas saring Whatman no. 1.
5.2.2 Aquades dengan nilai conductivity pada 25 °C max 2 μS/cm.
5.2.3 Kertas pH 0-14 indikator universal.
5.2.4 Methanol (CH3OH), 67-56-1, analytical grade, ≥ 99.9 %.
5.2.5 Sodium hydroxide (NaOH), 1310-73-2, analytical grade, ≥ 99.0 %.
5.2.6 Hydrochloric acid fuming (HCl), 7647-01-0, analytical grade, 37.0 % – 38.0
%.
5.2.7 Aflatoxin B1 kit AgraQuant® 2/50 atau Ridascreen® 30/15.
Item kit AgraQuant® Ridascreen®
Antibody-coated Ada Ada
microwells
Mixing wells Ada Tidak ada
Conjugate solution Green-capped bottle Red-capped bottle
Antibody solution Tidak ada Black-capped bottle
Substrate solution Blue-capped bottle Brown-capped bottle
Stop solution Red-capped bottle Yellow-capped bottle
Buffer Blue-capped bottle Sachet (wash powder
Tween)
Aflatoxin B1 standard 1 0 ppb 0 ppb
Aflatoxin B1 standard 6 Tidak ada 50 ppb
Test kit disimpan pada suhu 2 ºC – 8 ºC. Sebelum digunakan, sebaiknya
test kit disiapkan sampai mencapai suhu ruang (18 ºC – 30ºC).
Waktu penyimpanan maksimum sesuai tanggal kadaluarsa yang
tercantum di test kit.
REGIONAL LABORATORY

5.2.8 Larutan Methanol 70 % (v/v).

Tuang 700 mL methanol (5.2.4) ke dalam gelas ukur 1000 mL.
Tambahkan aquades (5.2.2) sampai tanda batas 1000 mL. Tuang larutan
ke dalam beaker glass, aduk hingga homogen. Pindahkan larutan ke
dalam botol reagen. Tulis tanggal pembuatan dan nama pembuat pada
label. Waktu penyimpanan maksimum 3 bulan.
5.2.9 Larutan Methanol 35 % (v/v).
Tuang 350 mL methanol (5.2.4) ke dalam gelas ukur 1000 mL.
Tambahkan aquades (5.2.2) sampai tanda batas 1000 mL. Tuang larutan
ke dalam beaker glass, aduk hingga homogen. Pindahkan larutan ke
dalam botol reagen. Tulis tanggal pembuatan dan nama pembuat pada
label. Waktu penyimpanan maksimum 3 bulan.
5.2.10 Larutan NaOH 1 N.
Larutkan 4 g ± 0.01 g Sodium hydroxide (5.2.5) dengan aquades (5.2.2)
dalam labu ukur 100 mL. Tambahkan aquades (5.2.2) sampai tanda
batas. Simpan dalam botol plastik berlabel. Tulis tanggal pembuatan dan
nama pembuat. Waktu penyimpanan maksimum 3 bulan.
5.2.11 Larutan HCl 1 N.
Encerkan 8.3 mL Hydrochloric acid fuming (5.2.6) dengan aquades
(5.2.2) dalam labu ukur 100 mL. Tambahkan aquades (5.2.2) sampai
tanda batas. Simpan dalam botol berlabel, tulis nama pembuat dan
tanggal pembuatan. Waktu penyimpanan maksimum 3 bulan.
5.2.12 Larutan induk Buffer Wash Tween.
Tuang bubuk wash powder tween (5.2.7) ke dalam botol, tambahkan 100
mL aquades dan aduk sampai homogen. Tulis tanggal pembuatan dan
nama pembuat pada label. Waktu penyimpanan maksimum 3 bulan dan
disimpan pada suhu ruang 20 - 25°C.
5.3.4.5. Larutan kerja Buffer Wash Tween.
Encerkan larutan induk buffer wash tween(5.2.11) ke dalam aquades
dengan perbandingan 1:9. Volume larutan sesuai kebutuhan pengujian
dan gunakan untuk sekali pakai.
5.2.14 Kertas Tisu
5.3 Cara Kerja

5.1 Preparasi contoh uji
No. Tahap AgraQuant® Ridascreen®
5.3.1.1. Timbang contoh uji Ya Ya
yang telah digiling
dengan ukuran
partikel 0.75 mm ke
dalam erlenmeyer
screw 100 mL.
REGIONAL LABORATORY

5.3.1.2. Lakukan ekstraksi 1 bagian contoh uji 5 g contoh uji

dengan dengan 5 bagian dengan 25 mL
menambahkan larutan methanol methanol 70%
larutan methanol 70 70% (5.2.8), (5.2.8).
% (5.2.8). contoh sebagai
berikut : 5 g contoh
uji dengan 25 mL
methanol 70%
(52.8).
Waktu ekstraksi 3 menit 3 menit
Kecepatan skala 4-5 jika skala 4-5 jika
pengadukan menggunakan menggunakan
multistirrer dan multistirrer dan
250 rpm jika 250 rpm jika
menggunakan menggunakan
shaking waterbath shaking waterbath
5.3.1.3. Saring contoh uji Ya Ya
menggunakan
kertas saring,
tampung filtrat ke
dalam vial atau
botol bertutup atau
centrifuge tube
screw.
5.3.1.4. Cek pH filtrat 6-8 Ya Tidak
menggunakan
kertas pH indikator
universal. Jika pH di
luar kisaran 6
sampai 8,
tambahkan dengan
larutan NaOH ± 1 N
(5.2.10) atau HCl ± 1
N (5.2.11).
5.3.1.5. Lakukan 1 bagian filtrat 1 mL filtrate
pengenceran filtrat (5.3.1.3) + 1 bagian (5.3.1.3) + 1 mL
REGIONAL LABORATORY


contoh uji. assay buffer (5.2.7). aquades.
Sebagai contoh 100
µL filtrat + 100 µL
assay buffer.
5.2 Penetapan Kadar Aflatoxin B1
5.3.2.1. Pasang mixing well Ya Tidak

untuk standar dan
contoh uji pada
microwell holder.
5.3.2.2. Pasang antibody- Ya Ya
coated microwell
untuk standar dan
contoh uji pada
microwell holder
yang sama.
5.3.2.3. Pipet conjugate 200 l atau 100 µL, 50 L (dipipet
solution. ke dalam dilution setelah contoh uji
well. dan standar), ke
dalam antibody-
coated well.
5.3.2.4. Pipet masing-masing 100 L atau 50 µL 50 L (dipipet
standar dan filtrat (rasio konjugat dan sebelum conjugate
contoh uji. standar/contoh uji solution)
adalah 2:1)
5.3.2.5. Pipet antibody Tidak. 50 µL.
solution.
5.3.2.6. Kocok larutan. Ya, 3x dengan Ya, dengan goyang
multichannel perlahan microwell
micropipette. holder
5.3.2.7. Pindahkan larutan ke 100 L. Tidak.
antibody-coated
microwell.
5.3.2.8. Inkubasi larutan 15 menit. 30 menit ± 1 menit
pada suhu ruang. pada suhu ruang
(20 ⁰C – 25 ⁰C) di
dalam ruang gelap.
5.3.2.9. Pencucian. Buang larutan Buang larutan
dalam well, isi dalam well dan
REGIONAL LABORATORY

masing-masing ketuk microwell

well dengan holder dengan
aquades (5.2.2). keras di atas kertas
Ulangi 4 kali lagi penyerap (tiga kali
dengan total berturut-turut).
pencucian 5x. Pipet 250 µL
Ketuk well dalam larutan kerja buffer
microwell holder wash tween
sampai sisa air (5.2.13) ke setiap
keluar. well. Buang larutan
Keringkan bagian dalam well lagi.
bawah well dengan Ulangi dua kali lagi.
kertas penyerap.
5.3.2.10. Pipet substrate 100 L. 100 L, goyang
solution. perlahan well
holder.
5.3.2.11. Inkubasi larutan 5 menit. 15 menit ± 1 menit
pada suhu ruang. pada suhu ruang (20
⁰C – 25 ⁰C) di dalam
ruang gelap.
5.3.2.12. Tambahkan stop 100 L. 100 L, goyang
solution. perlahan microwell
holder.
5.3.2.13. Ukur optical density Panjang gelombang Panjang gelombang
dan contoh uji 450 nm dengan 450 nm.
dengan panjang gelombang Pengukuran optical
menggunakan reader referensi 630 nm. density dilakukan
microwell atau Pengukuran optical maksimum 15
spectrophotometer density dilakukan menit setelah
dengan microplate. maksimum 10 penambahan stop
menit setelah solution,
penambahan stop
solution.
5.3 Pengenceran Filtrat Larutan Contoh Uji

Jika nilai aflatoxin B1 larutan contoh uji di atas larutan aflatoxin B1
standard tertinggi, encerkan larutan filtrat contoh uji.
No. Pengenceran AgraQuant® Ridascreen®
5.3.3.1. Filtrat contoh uji Encerkan larutan Encerkan larutan

filtrat contoh uji contoh uji 8.1.5.
REGIONAL LABORATORY

No. Pengenceran AgraQuant® Ridascreen®
pada 5.3.1.4. dengan dengan larutan

larutan methanol 70 methanol 35 %.
%.
5.3.3.2. Target sampai konsentrasi sampai
larutan contoh uji konsentrasi
berada di antara larutan contoh uji
konsentrasi larutan berada di antara
aflatoxin B1 konsentrasi
standard 2 dan larutan aflatoxin
konsentrasi larutan B1 standard 2 dan
aflatoxin B1 konsentrasi
standard 5. larutan aflatoxin
B1 standard 6.
5.3.3.3 Penetapan Aflatoxin Lakukan prosedur Lakukan prosedur
B1. 5.3.1.5. dan 5.3.2 5.3.2 untuk larutan
untuk larutan filtrat filtrat yang sudah
yang sudah diencerkan.
diencerkan.
5.4 Persyaratan kendali mutu.

Parameter AgraQuant® Ridascreen®
Koefisien korelasi Diantara -0.990 dan - Tidak dipersyaratkan.
kurva standar. 1.000.
Nilai optical density Di atas 0.5 A. Jika Di atas 0.6 A. Jika
untuk standar 0 diperoleh OD di bawah diperoleh OD di bawah 0.6
ppb. 0.5 A maka reagen dalam A maka reagen dalam
kondisi kadaluarsa. kondisi kadaluarsa.
Bentuk kurva Linear. Bentuk kurva seperti
bentuk kurva di Certificate
of Analysis.
50 % inhibition Tidak dipersyaratkan. 50 % inhibition kurva
standar dalam kisaran ±
30 % dari 50 % inhibition
kit yang terdapat di
Certificate of Analysis.
5.4 PERHITUNGAN
REGIONAL LABORATORY

No. AgraQuant® Ridascreen®

5.4.1. Catat perhitungan di buku kerja [F-061] Aflatoxin B1 [FTC-67.01].
5.4.2. Hitung konversi.
S
konversi =
S tanpa desimal
di mana:
S : bobot contoh uji (g)
Hitung faktor pengenceran.

5.4.3 Jika ada tahap pengenceran di 5.3.3, faktor pengenceran dihitung
dengan cara sebagai berikut :
( volume pelarut +volume filtrat contoh uji yang dipipet )
F=
volume filtrat contoh uji yang dipipet
5.4.4. Untuk mencari nilai konsentrasi Untuk mencari nilai

aflatoxin B1 dari suatu contoh uji konsentrasi aflatoxin B1 dari
dapat dihitung dengan cara suatu contoh uji dapat
menginterpolasi kurva standar dihitung dengan cara
dengan nilai log konsentrasi menginterpolasi kurva
sebagai axis dan nilai Logit B/B 0 standar dengan nilai log
sebagai ordinat. konsentrasi sebagai axis.
X = Log C
Y = Logit B/B0
Dimana :
logit
B
=
log ( )
B
B0
( )
B0 B
1- log
B0
B adalah nilai optical density
standar
B0 adalah nilai optical density
aflatoxin B1 standard 1.
5.4.5. Dari kurva standar dengan bantuan Perhitungan dilakukan

Microsoft Excel, hitung nilai slope, menggunakan software the
intercept dan koefisien korelasi RIDA®SOFT Win.net (ART.
(R). Nr. R9996) cubic spline.
Hitung konsentrasi aflatoxin B1
contoh uji.
Log C =
( Logit B
B0 ) – intercept
slope
REGIONAL LABORATORY

No. AgraQuant® Ridascreen®

( log C )
Aflatoxin B1 = 10 conto h uji
Di mana:
B adalah nilai optical density dari
contoh uji.
B0 adalah nilai optical density dari
aflatoxin B1 standard 1.
5.4.6. Aflatoxin B1 = Aflatoxin B1 dari 5 .4 .5 × F × Konversi
(ppb)
6. Annexes
-
7. Bibliography
7.1. Komite Akreditasi Nasional. 2019. KAN 01.02 Persyaratan Tambahan
Akreditasi Laboratorium Pengujian Kimia untuk persyaratan aquades.

Ftc-67.01 Aflatoxin b1 Elisa

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Ftc-67.01 Aflatoxin b1 Elisa

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PT.

CHAROEN POKPHAND INDONESIA

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

5.2.5 Micropipette single channel kapasitas 100 µL.

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

5.2.8 Larutan Methanol 70 % (v/v).

5.3 Cara Kerja

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

No. Tahap AgraQuant® Ridascreen®

5.3.1.2. Lakukan ekstraksi 1 bagian contoh uji 5 g contoh uji

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

No. Tahap AgraQuant® Ridascreen®

5.2 Penetapan Kadar Aflatoxin B1

No. Tahap AgraQuant® Ridascreen®

5.3.2.1. Pasang mixing well Ya Tidak

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

No. Tahap AgraQuant® Ridascreen®

masing-masing ketuk microwell

5.3 Pengenceran Filtrat Larutan Contoh Uji

No. Pengenceran AgraQuant® Ridascreen®

5.3.3.1. Filtrat contoh uji Encerkan larutan Encerkan larutan

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

No. Pengenceran AgraQuant® Ridascreen®

pada 5.3.1.4. dengan dengan larutan

5.4 Persyaratan kendali mutu.

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

No. AgraQuant® Ridascreen®

Hitung faktor pengenceran.

5.4.4. Untuk mencari nilai konsentrasi Untuk mencari nilai

5.4.5. Dari kurva standar dengan bantuan Perhitungan dilakukan

FTC-67.01 PENETAPAN AFLATOXIN B1 DENGAN Revisi : 00

No. AgraQuant® Ridascreen®

Anda mungkin juga menyukai