No.

Dok : WI/LAB/00
No. Rev :0
WORKING INSTRUCTION Tanggal Berlaku :
Halaman : 1 dari 7
JUDUL : Dibuat Disetujui Diketahui

PROTOKOL VERIFIKASI METODE

LABORATORIUM QC PENENTUAN KADAR POLIFENOL
DALAM EKSTRAK KERING TEH
HIJAU Staff Teknis Manajer Teknis Doc. Controller

1. TUJUAN
Sebagai pedoman untuk kegiatan verifikasi metode analisis penentuan kadar polifenol dalam ekstrak
kering teh hijau di laboratorium QC PT. Haldin Pacific Semesta.

2. RUANG LINGKUP
Prosedur ini berlaku untuk kegiatan verifikasi metode analisis penentuan kadar polifenol dalam ekstrak
kering teh hijau secara spektrofotometri mengacu pada ISO 14502-1 “ Determination of substances
characteristic of green and black tea - Part 1 : Determination of total polyphenols in tea-Colorimetric method
using Folin-Ciocalteu reagent” berdasarkan parameter verifikasi metode analisis di laboratorium QC PT.
Haldin Pacific Semesta.

3. PENANGGUNG JAWAB
3.1 Supervisor Teknis
3.2 Analis

4. DEFINISI
4.1 Polifenol
Kelompok senyawa kimia dengan lebih dari satu unit fenol per molekul. Polifenol ditemukan secara
alami pada tumbuhan. Jenis polifenol yang paling sering ditemukan pada tanaman adalah flavonoid,
asam fenolat, catechin, anthocyanin, isoflavon, quercetin, dan resveratrol.

5. PROSEDUR
5.1 Persyaratan Teknis
5.1.1 Uji Linearitas
a. Pengujian linearitas dilakukan terhadap deret standar larutan asam galat.
b. Pengujian liniearitas dilakukan dengan menganalisis 5 titik konsentrasi larutan secara
duplo dan random pada periode waktu yang pendek.
c. Kriteria keberterimaan uji linearitas adalah koefisien korelasi (R) minimum 0,99.
 No. Dok : WI/LAB/
PROTOKOL VERIFIKASI METODE No. Rev : 00
PENENTUAN KADAR POLIFENOL
Tanggal Berlaku :
DALAM EKSTRAK KERING TEH
HIJAU Halaman : 2 dari 7

5.1.2 Uji Akurasi

a. Pengujian akurasi dilakukan terhadap 3 sampel ekstrak kering teh hijau yang telah
ditambahkan standar asam galat (spike) dengan konsentrasi yang berbeda yang mewakili
rentang kerja metoda dan dianalisis sebanyak 7 kali pengulangan. Ketiga sampel dapat
dianalisis pada waktu yang berlainan namun pengulangan analisis pada sampel yang
sama harus dilakukan pada periode waktu yang pendek.
b. Kriteria keberterimaan uji akurasi adalah nilai recovery berada pada 98 - 102 %.

5.1.3 Uji Presisi

a. Pengujian presisi dilakukan terhadap 3 sampel ekstrak kering teh hijau dengan kadar
analit polifenol yang berbeda yang mewakili rentang kerja metoda dan dianalisis
sebanyak 7 kali pengulangan. Ketiga sampel dapat dianalisis pada waktu yang berlainan
namun pengulangan analisis pada sampel yang sama harus dilakukan pada periode
waktu yang pendek.
b. Pengujian presisi repeatability dilakukan oleh 1 orang analis. Pengujian intermediate
precision dilakukan oleh lebih dari 1 orang analis.
c. Kriteria keberterimaan uji presisi adalah nilai standar deviasi hasil pengujian maksimum
0,97.

5.1.4 Uji Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)

a. Pengujian LOD dan LOQ dilakukan terhadap sampel ekstrak kering teh hijau dengan
konsentrasi yang sangat rendah sebanyak 10 kali pengulangan dalam periode waktu yang
pendek.

5.1.5 Uji Ketegaran (Ruggedness)

a. Pengujian ketegaran dilakukan dengan menganalisis sampel madu dengan melakukan
perubahan pada 7 parameter analisis.

5.2 Cara Kerja

5.2.1 Alat & Bahan
a. Neraca Analitik
b. Spektrofotometer UV-Vis
c. Labu ukur 25 mL, 50 mL, 100 mL dan 200 mL
 No. Dok : WI/LAB/
PROTOKOL VERIFIKASI METODE No. Rev : 00
PENENTUAN KADAR POLIFENOL
Tanggal Berlaku :
DALAM EKSTRAK KERING TEH
HIJAU Halaman : 3 dari 7
d. Pipet volumetrik 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL dan 5 mL
e. Pipet ukur 5 mL
f. Beaker glass 100 mL dan 500 mL
g. Pemanas air
h. Green Tea Powder Extract cd.80
i. Green Tea Powder Extract cd.81
j. Green Tea Powder Extract cd.82
k. Green Tea Powder Extract 1/4 fold
l. Asam galat standard Lot. S7223649719
m. Polish water / aquadest
n. Larutan Folin Ciocalteau (FC) 10%
o. Larutan natrium karbonat 7.5%
p. Alumunium foil

5.2.2 Pembuatan larutan folin ciocalteau (FC) 10%

a. Pipet 20 mL larutan Folin Ciocalteau pekat (2 N) ke dalam labu ukur 200 mL.
b. Tambahkan aquades hingga tanda tera dan dihomogenkan.
c. Simpan dalam botol coklat agar telindungi dari cahaya.

5.2.3 Pembuatan larutan Na2CO3 7.5%

a. Timbang 15 gram Na2CO3, dimasukkan ke dalam Labu ukur 200 mL.
b. Tambahkan 100 mL aquades hangat, dilarutkan hingga larut sempurna menggunakan
magnetic stirer.
c. Dinginkan hingga suhu ruang, tanda bataskan dengan aquades dan dihomogenkan.

5.2.4 Pembuatan larutan stok standar asam galat

a. Timbang 0.100 ± 0,001 g standar asam galat, kemudian masukkan ke dalam labu ukur
100 mL
b. Larutkan dengan aquades, diencerkan hingga tanda batas kemudian dihomogenkan.

5.2.5 Pembuatan deret standar asam galat

a. Pipet sejumlah tertentu larutan stok asam galat (4.3) menggunakan pipet volumetrik
(tabel 1) , ke dalam labu ukur 100 mL dan diencerkan hingga tanda batas dengan
aquades kemudian dihomogenkan.
Volume larutan stok Konsentrasi akhir
Kode
asam galat (mL) (ppm)
A 1 10
B 2 20
C 3 30
D 4 40
E 5 50
Tabel 1. Pembuatan deret standar asam galat
 No. Dok : WI/LAB/
PROTOKOL VERIFIKASI METODE No. Rev : 00
PENENTUAN KADAR POLIFENOL
Tanggal Berlaku :
DALAM EKSTRAK KERING TEH
HIJAU Halaman : 4 dari 7
5.2.6 Penentuan kandungan bahan kering sampel ekstrak teh hijau
a. Sampel ditentukan kandungan bahan keringnya dengan melakukan penentuan moisture
content dalam ekstrak kering teh hijau mengacu pada ISO 7513:1990 “ Instant Tea In
Solid Form - Determination of Moisture Content (Loss In Mass at 103oC)”
b. Kandungan bahan kering = 100% - Moisture content

5.2.7 Ekstraksi polifenol dalam ekstrak kering teh hijau

a. Timbang 0,500 ± 0,001 g sampel uji ke dalam labu ukur 50 mL.
b. Tambahkan 25 mL air panas (temperatur maksimum 60 oC), dihomogenkan hingga larut.
c. Dinginkan hingga temperatur ruang.
d. Tambahkan 5 mL Asetonitril.
e. Tanda bataskan dengan aquades dan dihomogenkan.
f. Pipet 1 mL larutan ke dalam labu ukur 100 mL, diencerkan hingga tanda batas kemudian
dihomogenkan.

5.2.8 Penentuan kadar polifenol dalam ekstrak kering teh hijau

a. Pipet 1 mL larutan standar A, B, C, D, E (4.4) menggunakan pipet volumetrik masing
masing ke dalam vial 20 mL.
b. Pindahkan 1 mL aquades menggunakan pipet volumetrik ke dalam vial 20 mL sebagai
blanko.
c. Pindahkan 1 mL larutan sampel (4.6) menggunakan pipet volumetrik ke dalam vial 20
mL.
d. Tambahkan 5 mL larutan Folin-Ciocalteu 10% menggunakan pipet volumetrik ke dalam
masing-masing vial tersebut dan diaduk.
e. Dalam rentang waktu 3-8 menit setelah penambahan larutan Folin-Ciocalteu 10%,
ditambahkan 4 mL larutan Natrium karbonat 7,5% ke dalam masing-masing vial
kemudian tutup dan homogenkan.
f. Diamkan dalam tempat gelap dan suhu ruang selama 60 menit, kemudian diukur
absorbansi larutan menggunakan spektrofotometer dengan tebal kuvet 10 mm terhadap
air pada panjang gelombang 765 nm.
g. Jika absorbansi sampel berada diluar rentang kurva standar, lakukan penyesuaian pada
pengenceran sampel (4.6 f)
5.2.9 Pengujian akurasi
a. Lakukan spike dengan menambahkan sejumlah tertentu standar asam galat ke dalam
sampel ekstrak kering teh hijau 1/4 fold sebagai berikut :
Konsentrasi Penimbangan Penimbangan Labu ukur
No.
Spike sampel standar (mL)
1 10 % 5,000 g 0,050 g 50
2 25 % 5,000 g 0,125 g 50
3 40 % 5,000 g 0,200 g 50
Tabel 2. Pembuatan spike untuk uji akurasi penentuan polifenol ekstrak kering teh hijau
 No. Dok : WI/LAB/
PROTOKOL VERIFIKASI METODE No. Rev : 00
PENENTUAN KADAR POLIFENOL
Tanggal Berlaku :
DALAM EKSTRAK KERING TEH
HIJAU Halaman : 5 dari 7

b. Masing-masing konsentrasi campuran tersebut dianalisa dengan 7 kali pengulangan.

c. Hitung nilai persen recovery dari standar asam galat untuk pengujian akurasi.

5.2.10 Pengujian Presisi

a. Lakukan pengujian kadar polifenol terhadap sampel green tea powder ekstrak kode 80,
81 dan 82 masing-masing dengan 7 kali pengulangan.
b. Hitung kadar polifenolnya dan SD (standard deviation) untuk pengujian Repeatability
dan Intermediate Precission.

5.3 Perhitungan
5.3.1 Kadar Polifenol
a. Dihitung hingga ketelitian 0,1 ug, bobot asam galat (m) dalam 1,0 mL larutan standar A,
B, C, D dan E dengan rumus:
m = m0 x V x wDM,std x 10000 / (100 x 100)

Dimana : m0 = bobot asam galat (gram) yang ditimbang untuk menyiapkan larutan
stok standar (4.3)
V = volume larutan stok standar (mL) yang dipipet untuk membuat larutan
standar A, B, C, D dan E (4.4)
wDMstd = kandungan kering dari standar atau kemurnian standar (%)

b. Dibuat kurva kalibrasi dari konsentrasi larutan standar terhadap absorbansi larutan
standar setelah dikurangi absorbansi blanko. Dihitung slope dan intercept hingga
ketelitian 0,0001. Jika intercept lebih dari ± 0,04 maka pengujian harus di investigasi.
Kadar total polifenol (wT) dalam % bobot dari sampel kering, dihitung dengan rumus :

wT = (D sampel - Intercept) x V sampel x d x 100

Sstd x m sampel x 10000 x wDM sampel

Dimana : D sampel = Absorbansi sampel

Vsampel = volume larutan sampel (50 mL)
wDMsampel = kandungan bahan kering dari sampel (4.1.5)
d = Faktor pengenceran sampel
Sstd = Slope kurva kalibrasi standar
m sampel = bobot sampel (gram)

5.3.2 Uji Linearitas

a. Perhitungan uji linearitas dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Microsoft
Excell.
 No. Dok : WI/LAB/
PROTOKOL VERIFIKASI METODE No. Rev : 00
PENENTUAN KADAR POLIFENOL
Tanggal Berlaku :
DALAM EKSTRAK KERING TEH
HIJAU Halaman : 6 dari 7
b. Adapun rumus koefisien korelasi pearson (r) adalah:
r= n . ∑xi.yi - ∑xi.∑yi

√(n.∑xi2 - (xi)2) . √( n.∑Nxi2 - (xi)2)

Ket : xi = variabel x (konsentrasi)

yi = variabel y (respon)
n = jumlah data

5.3.3 Uji Akurasi

R (%) = X’- X x 100 %
X spike
Dimana : R = % recovery
X = Rata-rata hasil pengujian sampel/matriks tanpa spike
X’ = Rata-rata hasil pengujian sampel setelah di-spike
X spike = Konsentrasi standar yang ditambahkan/di-spike

5.3.4 Uji Presisi

a. Standar Deviation dari hasil pengujian (si) ditentukan dengan rumus :
si = [∑(xi - (x))2/n]0.5

Dimana: si : Standar Deviation

xi : Hasil uji
x : Nilai Rata-rata hasil uji
n : jumlah pengulangan pengujian/replikasi

5.3.5 Uji Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)

a. Standar Deviation dari hasil pengujian (si) ditentukan dengan rumus :
si = [∑(xi - (x))2/n]0.5

Dimana: si : Standar Deviation

xi : Hasil uji
x : Nilai Rata-rata hasil uji
n : jumlah pengulangan pengujian/replikasi
 No. Dok : WI/LAB/
PROTOKOL VERIFIKASI METODE No. Rev : 00
PENENTUAN KADAR POLIFENOL
Tanggal Berlaku :
DALAM EKSTRAK KERING TEH
HIJAU Halaman : 7 dari 7

b. Batas deteksi (LOD) ditentukan dengan rumus :

LOD = Rata-rata + 3x si
Dimana: si : Standar Deviation
c. Batas kuantifikasi (LOQ) ditentukan dengan rumus :
LOD = Rata-rata + 10x si
Dimana: si : Standar Deviation

6. REFERENSI
6.1 ISO. 2005. International Organization for Standardization (ISO) 14502-1. Determination of
substances characteristic of green and black tea - Part 1: Determination of total polyphenols in
tea-Colorimetric method using Folin-Ciocalteu reagent.
6.2 AOAC. 2016. Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL Appendix F : Guidelines for
Standard Method Perfoemance Requirements.
6.3 WI/LAB/013 Validasi dan Verifikasi Metode Analisis.

7. RIWAYAT PERUBAHAN

Revision Number Changes