Uji Endotoksin → Untuk mengtahui ada atau tidaknya endotoksin pada sediaan farmasi dilakukan pengujian endotoksin

Menggunakan (Limulus Amebocrtye Lysate) LAL test

Prinsip Uji → memanfaatkan respon imun dari Limulus polyphemus terhadap bakteri gram negatif yang akan membentuk gumpalan
seperti gel

Metode :

1. Gel Cloth (Jendal Gel)

Prinsip → Dapat mendeteksi endotoksin berdasarkan pereaksi LAL yang bereaksi dengan endotoksin

Interpretasi → kadar endotoksin kurang dari nilai yang tertera pada monografi

2. Fotometrik

Prinsip → mendeteksi endotoksin dengan menggunakan peningkatan kekeruhan karena reaksi LAL dan endotoksin

Interpretasi → sediaan uji memenuhi syarat jika rata-rata kadar endotoksin dari replikasi larutan A, setelah koreksi pengenceran dan
kadar, lebih kecil dari batas endotoksin produk
Cara Kerja Secara Umum

Penyiapan Larutan Induk Baku Pembanding dan Larutan Baku Pembanding Endotoksin

- Konstitusi seluruh isi vial BPE dengan 5 ml air pereaksi LAL

- Campur dg pengocok vortex secara intermiten selama 30 menit
- Simpan di lemari pendingin dan sebelum digunakan kocok kuat dengan pengocok vortex selama < 3 menit

Uji Persiapam

- Gunakan pereaksi LAL yang sudah ditetapkan sesuai etiket

Penyiapan Larutan Uji

- Siapkan larutan uji dg melarutkan/mengencerkan obat,/mengekstraksi alat Kesehatan dg air pereaksi LAL

Penetapan Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA)

Penetapan Batas Endotoksin

Cara Kerja Metode Jendal Gel

1. Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel

a. Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL (menggunakan tidak kurang dan 1 vial untuk setiap lot pereaksi LAL)
- Buat pengenceran seri kelipatan 2 dan BPE dalam Air Pereaksi LAL hingga konsentrasi 2λ; λ; 0,5 λ dan 0,25 λ
- Lakukan uji pada 4 konsentrasi larutan baku, dalam 4 replikasi termasuk kontrol negative
- Campur pereaksi LAL dengan larutan baku dan masing-masing konsentrasi dalam tabung uji dengan volume yang sama
(0,1 ml).
- Inkubasi campuran reaksi dalam waktu yang tetap sesuai dengan petunjuk produsen pereaksi LAL (biasanya 37°±1°,
selama 60±2 menit)
 - Uji integnitas gel. Untuk menguji integnitas gel, ambil setiap tabung langsung daei inicubator dan balikkan 180 secara
perlahan-lahan.
2. Uji Faktor Pengganggu
-Siapkan larutan A, B, C, dan D
-lakukan uji penghambatan atau pemacuan pada larutan sampel yang diencerkan kurang dari PMA
-ikuti prosedur dalam Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL Rata-rata geometrik konsentrasi titik akhir dari larutan B dan C
-ditetapkan dengan menggunakan persamaan uji di atas
Interpretasi → Uji ini harus diulang apabila terjadi perubahan kondisi yang dapat mempengaruhi hasil uji. Uji dinyatakan
absah apabila larutan A dan D memberikan hasil negatif, dan hasil larutan C sesuai dengan kepekaan yang tertera pada etiket.
Jika kepekaan lysate yang diperoleh dalam larutan uji pada larutan B tidak kurang dari 0,5 dan tidak lebih dari 2 , maka
larutan uji tidak mengandung faktor pengganggu pada kondisi uji yang digunakan. Jika sebaliknya, berarti terdapat faktor
penggangu. Jika sampel yang diuji tidak memberikan hasil yang sesuai pada pengenceran yang digunakan ,ulangi uji
menggunakan pengenceran yang lebih besar, tetapi tidak boleh melebihi PMA.
3. Uji Batas Jendal Gel
- Siapkan larutan A, B, C dan D sesuai aturan di Tabel 2 dan lakukan pengujian larutan ini mengikuti prosedur Uji
Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL, yang dijelaskan dalam Uji Persiapan Cara Jendal Gel.
4. Penetapan Kadar Endotoksin
- dihitung hitung kadar titik akhir setiap seri replikasi dari pengenceran dengan mengalikan tiap faktor pengenceran titik
akhir dengan lamda
- dihitung kadar rata rata titik akhir

INTERPRETASI : Bahan memenuhi syarat jika kadar endotoksin kurang dari nilai yang dinyatakan pada masing masing etiket
Cara Kerja Metode Fotometrik

1. Uji Persiapan Cara Fotometrik

- Dilakukan uji persiapan untuk memverifikasi kriteria kurva baku yang absah dan larutan sampel tidak menghambat atau
memacu reaksi.
2. Verifikasi Kriteria Kurva Baku

- Dengan menggunakan larutan endotoksin baku, siapkan minimal 3 kadar endotoksin untuk membuat kurva baku.

- Nilai absolut dari koefisien korelasi, │r│, harus lebih besar atau sama dengan 0,980 untuk rentang kadar endotoksin
sebagaimana ditetapkan oleh produsen pereaksi LAL.

3. Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Fotometrik

- Siapkan larutan A, B, C dan D seperti yang tertera pada Tabel 4.
- Lakukan uji terhadap larutan A, B, C dan D minimal duplo sesuai instruksi untuk Pereaksi LAL yang digunakan (volume
sampel dan pereaksi LAL, perbandingan volume sampel dengan pereaksi LAL, waktu inkubasi, dan lain-lain).
- hasil pengukuran kadar endotoksin yang ditambahkan pada sampel harus berada diantara 50%-200% dari kadar endotoksin
yang ditambahkan
4. Perhitungan Untuk Cara Fotometrik
- Hitung kadar endotoksin dari tiap-tiap replikasi larutan uji A, menggunakan kurva baku yang dibuat dengan kontrol positif
larutan C.
- Uji dinyatakan absahjika kondisi berikut dipenuhi:
(1) Hasil kontrol positif larutan C memenuhi persyaratan validasi yang ditetapkan pada Verifikasi Kriteria Kurva Baku dalam
Uji Persiapan Cara Fotometrik;
 (2) Perolehan kembali endotoksin, dihitung dari konsentrasi endotoksin larutan B setelah dikurangi konsentrasi endotoksin
larutan A, berada pada rentang 50% – 200%; dan
(3) Hasil kontrol negatif larutan D tidak melebihi batas nilai blangko yang dipersyaratkan dalam uraian pereaksi LAL yang
digunakan.
5. Penafsiran Hasil Cara Fotometrik
Uji memenuhi syarat jika rata-rata kadar endotoksin dari replikasi larutan A, setelah koreksi pengenceran dan kadar, lebih kecil
dari batas endotoksin produk.
 Cara Kerja & Form Data Pengamatan
Uji Endotoksin
Kelompok 8/B

Irhamna Yulia N.S I1C018072

Nur Intan A. M I1C018074
Larasati Maharani I1C018078
Maylani Anjani S. I1C018080
Shabrina Angger P. I1C018082
Monica Ramadhanti I1C018100

I. Cara Kerja Diagram Alir

a. Cara Kerja Secara Umum

Alat dan bahan

 Disiapkan alat dan bahan peralatan gelas dan bahan tahan panas
lainnya dalam oven udara panas menggunakan proses yang telah
divalidasi, microplate, dan pipet tips.

Larutan Induk Baku Pembanding

Dan Larutan Baku Pembanding
endotoksin
 Dikonstitusi seluruh isi vial BPE dengan 5 ml air pereaksi LAL
 Dicampur dengan pengocok vortex secara intermiten selama 30 menit
 Disimpan di lemari pendingin selama tidak lebih 14 hari dan sebelum
digunakan kocok kuat dengan pengocok vortex selama < 3 menit

Uji Persiapan

 Digunakan pereaksi LAL yang sudah ditetapkan sesuai etiket

Penyiapan Larutan
uji
 Disiapkan larutan uji dengan melarutkan/mengencerkan obat, atau
mengekstraksi alat kesehatan dengan Air Pereaksi LAL.
 Diatur pH larutan rentang pH 6,0-8,0 (atau hasil pengencerannya) yang akan
diuji hingga pH campuran pereaksi LAL dan larutan uji terletak pada
rentang pH yang ditentukan oleh produsen pereaksi LAL.
 Penetapan Pengenceran Maksimum
yang Absah (PMA)

 Diberlakukan untuk injeksi atau larutan parenteral terkonstitusi atau

diencerkan, atau jika diperlukan, untuk jumlah obat dalam bobot jika
volume obat yang diberikan bervariasi.

Penetapan Batas Endotoksin

 Ditetapkan berdasarkan dosis, sama dengan K/M.

Batas Endotoksin

b. Cara Kerja Metode Jendal Gel

1. Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL

Zat Uji

 Dibuat pengenceran seri kelipatan 2 dan BPE dalam Air Pereaksi LAL
hingga konsentrasi 2λ; λ; 0,5 λ; dan 0,25 λ
 Dilakukan uji pada 4 konsentrasi larutan baku, dalam 4 replikasi
termasuk kontrol negative
 Dicampur pereaksi LAL dengan larutan baku dan masing-masing
konsentrasi dalam tabung uji dengan volume yang sama (0,1 ml).
 Dinkubasi campuran reaksi dalam waktu yang tetap sesuai dengan
petunjuk produsen pereaksi LAL (biasanya 37°C±1°C, selama 60±2
menit).

Uji Integritas

 Diambil setiap tabung langsung dari inicubator dan balikkan 180°

secara perlahan.
 Jika telah terbentuk gel yang kuat, yang tetap di tempatnya walaupun
telah dibalik, catat sebagai hasil positif. Jika gel tidak terbentuk atau
gel yang terbentuk jatuh ketika dibalik, maka hasil dinyatakan negatif.

Gel Terbentuk (positif / negatif)

2. Uji Faktor Pengganggu

Larutan A, B, C, dan D

 Disiapkan larutan A, B, C, dan D

 Dilakukan uji penghambatan atau pemacuan pada larutan sampel yang
diencerkan kurang dari PMA
 Dilakukan uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL rata-rata geometrik
konsentrasi titik akhir dari larutan B dan C
 Ditetapkan dengan menggunakan persamaan uji di atas

Hasil Faktor Pengganggu

(positif/negatif)

3. Uji Batas Jendal Gel

Larutan A, B, C, dan D

 Disiapkan Larutan A, B, C, dan D seperti tertera pada tabel 2 pada

Farmakope VI halaman 1893
 Dilakukan pengujian larutan ini mengikuti prosedur Uji Konfirmasi
Kepekaan Pereaksi LAL, yang dijelaskan dalam Uji Persiapan Cara
Jendal Gel.
 Diperoleh hasil uji positif/negatif.
Hasil Kontrol (positif/negatif)

4. Penetapan Kadar Endotoksin

Larutan A,B,C,D

 Disiapkan larutan A, B, C, dan D seperti pada tabel 3 pada

Farmakope VI halaman 1893
 Dilakukan uji pada keempat larutan tersebut dengan mengikuti
prosedur Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL yang tertera dalam
Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel.
 Kemudian dihitung kadar titik akhir setiap seri replikasi dari
pengenceran dengan mengalikan tiap faktor pengenceran titik akhir
dengan λ.
Kadar rata-rata titik akhir
Cara Kerja Metode Fotometrik
1. Verifikasi Kriteria Kurva Baku

Larutan
Endotoksin Baku

 Disiapkan minimal 3 kadar endotoksin untuk membuat kurva baku

menggunakan larutan endotoksin baku.
 Dilakukan pengujian dengan minimal 3 replikasi untuk masing-
masing kadar endotoksin baku sesuai instruksi produsen pereaksi
LAL (perbandingan volume, waktu inkubasi, suhu, pH, dll).
 Jika rentang yang diinginkan dalam metode kinetik lebih besar dari 2
log, maka harus dimasukkan larutan baku tambahan, agar setiap
kenaikan log tetap berada dalam rentang kurva baku
 Nilai absolut dari koefisien korelasi, │r│' harus lebih besan atau
sama dengan 0,980 untuk nentang kadar endotoksin sebagaimana
ditetapkan oleh produsen peneaksi LAL
 Dibuat Kurva baku

Kurva Baku

2. Uji Faktor Pengganggu

Kadar endotoksin

 Dipilih satu kadar endotoksin pada atau di sekitar pertengahan

kurva baku endotoksin

Larutan A, B, C, dan D

 Disiapkan dan dilakukan uji terhadap larutan A, B, C dan D

minimal duplo sesuai instruksi untuk Pereaksi LAL yang
digunakan (volume sampel dan pereaksi LAL, perbandingan
volume sampel dengan pereaksi LAL, waktu inkubasi, dan lain-
lain)

Hasil Faktor Pengganggu

(positif/negatif)
 3. Perhitungan Untuk Cara Fotometrik

Replikasi larutan uji A

 Dihitung kadar endotoksin dari tiap-tiap replikasi larutan uji A,

menggunakan kurva baku yang dibuat dengan kontrol positif
larutan C

Kadar endotoksin

II. Form Data Pengamatan

a. Metode Jendal Gel
Uji Kepekaan Pereaksi LAL Uji Faktor Pengganggu
Uji Integritas Gel (positif/negatif)
(Gel Terbentuk (positif/negatif))
Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan
1 2 3 4 A B C D

Kadar Endotoksin Sampel

Larutan A Larutan B Larutan C Larutan D
Replikasi 1
Replikasi 2
Rata-Rata Kadar

b. Metode Fotometrik
Kurva Baku
Absorbansi Larutan A Larutan B Larutan C Larutan D
Replikasi 1
Replikasi 2
Replikasi 3

Uji Faktor Pengganggu (-/+)

Larutan A Larutan B Larutan C Larutan D
Replikasi 1
Replikasi 2

Kadar Endotoksin Sampel

Larutan A Larutan B Larutan C Larutan D
Replikasi 1
Replikasi 2
Rata-Rata Kadar