- 1890 -
histamin basa per kg dalam seluruh seri, awal dan
tambahan dan hitung rata-rata semua perbedaan
tersebut. Pengujian memenuhi syarat bila rata-rata
dari perbedaan tersebut sedemikian hingga respons
hipotensif terhadap larutan uji tidak lebih besar dari
respons hipotensif yang disebabkan penyuntikan 0,1
µg histamin basa per kg, dan jika tidak lebih dari
setengah dari respons hipotensif terhadap larutan uji
lebih besar dari respons rata-rata dari masing-masing
respons hipotensif yang disebabkan penyuntikan 0,1
µg histamin basa per kg.
ENDOTOKSIN BAKTERI <201>
Uji endotoksin bakteri adalah uji untuk mendeteksi
atau mengkuantitasi endotoksin bakteri yang mungkin
terdapat dalam sampel yang diuji. Pengujian
dilakukan menggunakan Limulus Amebocyte Lysate
(LAL) yang diperoleh dari ekstrak air amebosit dalam
kepiting ladam kuda (Limulus polyphemus atau
Tachypleus tridentatus) dan dibuat khusus sebagai
pereaksi LAL. [Catatan: Pereaksi LAL bereaksi
dengan beberapa β-glukan bila ditambahkan pada
endotoksin. Beberapa sediaan yang diperlakukan
tidak bereaksi dengan β-glukan dan harus digunakan
untuk contoh yang mengandung glukan.]
Terdapat dua tipe teknik uji, teknik pembentukan
jendal gel dan teknik fotometrik. Teknik fotometrik
mencakup metode turbidimetri, yang didasarkan pada
pembentukan kekeruhan setelah penguraian substrat
endogen, dan metode kromogenik yang didasarkan
pada pembentukan warna setelah terjadi penguraian
kompleks kromogen-peptida sintetik. Lakukan salah
satu dari teknik tersebut, kecuali jika dinyatakan lain
dalam monografi. Jika terjadi keraguan, maka
keputusan akhir didasarkan pada hasil Teknik
Pembentukan Jendal Gel, kecuali dinyatakan lain
dalam monografi.
Pada Teknik Pembentukan Jendal Gel, penetapan
titik akhir reaksi dilakukan dengan membandingkan
langsung enceran dari zat uji dengan enceran
endotoksin baku, dan jumlah endotoksin dinyatakan
dalam unit Endotoksin (UE).
Pereaksi LAL diformulasikan juga untuk
digunakan dalam pengujian turbidimetri dan
kolorimetri, maka pengujian-pengujian tersebut dapat
digunakan untuk memenuhi persyaratan yang
ditetapkan. Kedua uji ini memerlukan pembuatan
kurva regresi baku dan kandungan endotoksin dari zat
uji ditetapkan dengan interpolasi dari kurva tersebut.
Prosedur meliputi inkubasi selama waktu yang telah
ditetapkan dari endotoksin yang bereaksi dan larutan
kontrol dengan pereaksi LAL, dan pembacaan
serapan cahaya pada panjang gelombang yang sesuai.
Pengukuran titik akhir pada prosedur secara
turbidimetri, pembacaan dilakukan segera pada akhir
masa inkubasi. Pengukuran titik akhir pada prosedur
secara kolorimetri, reaksi dihentikan pada akhir dari
waktu yang telah ditetapkan, dengan penambahan zat
pemutus-reaksi-enzim, sebelum pengukuran. Pada
penetapan kadar secara kinetik (turbidimetri dan
kolorimetri), serapan diukur selama periode reaksi
dan dari pengukuran tersebut ditetapkan nilai
kecepatan reaksi.
ALAT DAN ALAT GELAS
Depirogenasi seluruh peralatan gelas dan bahan
tahan panas lainnya dalam oven udara panas
menggunakan proses yang telah divalidasi. [Catatan:
Prosedur untuk uji validasi inaktifasi endotoksin,
lihat Sterilisasi Pemanasan Kering dalam Sterilisasi
dan Jaminan Sterilitas untuk Bahan Kompendial
<1371>. Gunakan pereaksi LAL dengan sensitivitas
tidak kurang dari 0,15 UE per mL]
Umumnya waktu dan suhu minimum yang
digunakan adalah 30 menit pada 250. Jika
menggunakan Peralatan plastik, misalnya microplate
dan pipet tips untuk pipet otomatis, gunakan hanya
yang sudah dibuktikan bebas endotoksin dan tidak
akan mengganggu pengujian. [Catatan: Pada bagian
ini, istilah tabung dimaksudkan untuk semua wadah ,
misalnya sumur mikro-titer].
PENYIAPAN LARUTAN INDUK BAKU
PEMBANDING DAN LARUTAN BAKU
PEMBANDING ENDOTOKSIN
Baku pembanding endotoksin (BPE) adalah
Endotoksin BPFI yang telah diketahui potensinya
dalam UE per vial. Konstitusi seluruh isi vial BPE
dengan 5,0 mL air pereaksi LAL3). [Catatan - Air
pereaksi LAL adalah air untuk injeksi atau air lain
yang tidak bereaksi dengan pereaksi LAL yang
digunakan pada batas kepekaan pereaksi].
Campur dengan pengocok vorteks secara
intermiten selama 30 menit. Gunakan larutan pekat ini
untuk membuat seri pengenceran yang sesuai. Simpan
larutan pekat dalam lemari pendingin, selama tidak
lebih dari 14 hari untuk membuat pengenceran
berikutnya. Sebelum digunakan kocok kuat dengan
pengocok vorteks selama tidak kurang dari 3 menit.
Campur setiap enceran tidak kurang dari 30 detik
sebelum membuat pengenceran berikutnya. Enceran
tidak boleh disimpan karena menyebabkan hilangnya
aktivitas oleh penyerapan, kecuali ada data penunjang
tentang hal ini.
Uji Persiapan
Gunakan Pereaksi LAL yang sudah ditetapkan
kepekaannya sesuai dengan yang tertera pada etiket.
Keabsahan hasil uji untuk endotoksin bakteri ini
memerlukan pembuktian yang cukup bahwa contoh
bahan atau larutan, pencuci, atau ekstrak yang
 - 1891 -
digunakan pada uji, tidak menghambat atau memacu
reaksi atau dapat mengganggu pengujian dengan cara
apapun. Validasi dilakukan dengan Uji
penghambatan atau pemacuan sebagaimana yang
diuraikan pada 3 teknik yang telah disebutkan
sebelumnya. Dalam uji ini harus dimasukkan kontrol
negatif yang sesuai. Validasi harus diulang jika
sumber Pereaksi LAL atau metode pembuatan atau
formulasi bahan berubah.
Penyiapan Larutan Uji
Siapkan larutan uji dengan melarutkan atau
mengencerkan obat, atau mengekstraksi alat
kesehatan dengan Air Pereaksi LAL. Beberapa bahan
atau sediaan mungkin lebih baik dilarutkan,
diencerkan atau diekstraksi dalam larutan
mengandung air lainnya. Jika perlu, atur pH larutan
(atau hasil pengencerannya) yang akan diuji hingga
pH campuran pereaksi LAL dan larutan uji terletak
pada rentang pH yang ditentukan oleh produsen
pereaksi LAL. Hal ini biasanya digunakan pada
produk dengan rentang pH 6,0-8,0. Pengaturan pH
dapat dilakukan dengan menggunakan asam, basa
atau larutan dapar yang sesuai dengan rekomendasi
produsen pereaksi LAL. Asam dan basa dapat dibuat
dari konsentrat atau padatan dengan Air Pereaksi LAL
dalam wadah bebas endotoksin. Larutan dapar harus
divalidasi bebas endotoksin dan faktor pengganggu.
PENETAPAN PENGENCERAN MAKSIMUM
YANG ABSAH (PMA)
Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA)
adalah pengenceran maksimum yang diperbolehkan
dari suatu contoh agar batas endotoksinnya dapat
ditetapkan. Pengenceran Maksimum yang Absah
diberlakukan untuk injeksi atau larutan parenteral
terkonstitusi atau diencerkan, atau jika diperlukan,
untuk jumlah obat dalam bobot jika volume obat yang
diberikan bervariasi. Persamaan umum untuk
menentukan PMA adalah:
PMA = (batas endotoksin x konsentrasi larutan
sampel)/
 adalah kepekaan Pereaksi LAL yang tertera pada
etiket (UE/mL).
Hubungan konsentrasi larutan sampel dan 
dijelaskan di bawah ini :
− Jika batas endotoksin dalam monografi dinyatakan
dalam konsentrasi (UE/mL), maka PMA dapat
dihitung dengan rumus:
PMA = batas endotoksin (UE/mL) / λ
− Jika batas endotoksin dalam monografi dinyatakan
dalam UE/mg atau UE/Unit, maka PMA dapat
dihitung dengan rumus umum tersebut di atas,
PMA = (batas endotoksin x konsentrasi sampel)/ λ
PMA yang diperoleh adalah batas pengeceran yang
diperbolehkan untuk uji yang absah.
Konsentrasi sample dengan satuan (mg/mL atau
Unit/mL).
PENETAPAN BATAS ENDOTOKSIN
Batas endotoksin obat parenteral, ditetapkan
berdasarkan dosis, sama dengan K/M.[Catatan: K
adalah 5 UE per kg untuk semua cara pemberian
selain dari intratekal (K adalah 0,2 UE per kg berat
badan). Untuk sediaan radiofarmaka yang tidak
diberikan secara intratekal, batas endotoksin
dihitung sebagai 175/V, V adalah dosis maksimum
dalam mL yang direkomendasikan. Untuk sediaan
radiofarmaka yang diberikan secara intratekal. Batas
endotoksin ditetapkan dengan rumus 14/V. Untuk
formulasi (biasanya produk antikanker) diberikan
berdasarkan pada m2 luas permukaan tubuh, dengan
rumus K/M, K= 5 UE per kg dan M adalah (dosis
maksimum/m2/jam x 1,80 m2)/ 70 kg.] K adalah dosis
ambang pirogenik endotoksin pada manusia per
kgberat badan, dan M sama dengan dosis maksimum
produk pada manusia per kg berat badan dalam
periode satu jam. Dalam masing-masing monografi,
batas endotoksin obat parenteral dinyatakan dalam
unit, misalnya UE/mL, UE/mg atau UE/unit aktivitas
biologi.
CARA JENDAL GEL
Cara jendal gel mendeteksi atau mengkuantitasi
endotoksin berdasarkan pembentukan jendal dari
pereaksi LAL dengan adanya endotoksin. Konsentrasi
endotoksin yang dibutuhkan untuk menyebabkan
lysate menjendal pada kondisi standar dinyatakan
sebagai kepekaan pereaksi LAL yang tertera pada
etiket. Untuk menjamin presisi dan keabsahan
pengujian, lakukan uji konfirmasi kepekaan pereaksi
LAL yang tercantum dalam etiket dan uji faktor
pengganggu seperti tertera dalam Uji Persiapan
untuk Cara Jendal Gel .
Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel
Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL
Lakukan konfirmasi kepekaan pereaksi yang tertera
pada etiket menggunakan tidak kurang dari 1 vial
untuk setiap lot pereaksi LAL. Buat pengenceran seri
kelipatan 2 dari BPE dalam Air Pereaksi LAL hingga
konsentrasi 2; ; 0,5; dan 0,25.  adalah kepekaan
pereaksi LAL yang tertera pada etiket (UE/mL).
Lakukan uji pada 4 konsentrasi larutan baku, dalam
4 replikasi termasuk kontrol negatif. Uji konfirmasi
kepekaan lysate dilakukan bila menggunakan
pereaksi LAL bets baru atau bila ada perubahan dalam
kondisi uji yang dapat mempengaruhi hasil uji.
Campur pereaksi LAL dengan larutan baku dari
masing-masing konsentrasi dalam tabung uji dengan
volume yang sama (0,1 mL). Jika digunakan vial atau
 - 1892 -
ampul uji tunggal berisi pereaksi LAL kering beku,
tambahkan larutan langsung ke dalam vial atau
ampul. Inkubasi campuran reaksi dalam waktu yang
tetap sesuai dengan petunjuk produsen pereaksi LAL
(biasanya 37  1, selama 60  2 menit), hindari
getaran. Untuk menguji integritas gel, ambil setiap
tabung langsung dari inkubator dan balikkan 180
secara perlahan-lahan. Jika telah terbentuk gel yang
kuat, yang tetap di tempatnya walaupun telah dibalik,
catat sebagai hasil positif. Jika gel tidak terbentuk atau
gel yang terbentuk jatuh ketika dibalik, maka hasil
dinyatakan negatif. Uji dinyatakan absah, jika larutan
baku konsentrasi terrendah memberikan hasil negatif
pada semua replikasi uji.
Titik akhir adalah konsentrasi terendah yang masih
memberikan hasil positif dari satu pengenceran seri.
Hitung nilai rata-rata dari logaritma konsentrasi
titik akhir, e, dan hitung antilogaritma dari nilai rata-
rata menggunakan rumus berikut:
Rata-rata geometrik konsentrasi titik akhir = antilog
(e/f)
e adalah jumlah logaritma konsentrasi titik akhir
dari pengenceran seri yang digunakan; dan f adalah
jumlah replikasi. Rata-rata geometri konsentrasi titik
akhir adalah hasil pengukuran kepekaan pereaksi
LAL (UE/mL). Jika hasil pengukuran kepekaan tidak
kurang dari 0,5 dan tidak lebih dari 2, maka
kepekaan yang tercantum di etiket sesuai dan dapat
digunakan dalam pelaksanaan pengujian dengan
lysate.
Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Jendal Gel.
Siapkan larutan A, B, C, dan D seperti tertera pada
Tabel 1 dan lakukan uji penghambatan atau pemacuan
pada larutan sampel yang diencerkan kurang dari
PMA, tidak mengandung endotoksin, dan ikuti
prosedur dalam Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi
LAL Rata-rata geometrik konsentrasi titik akhir dari
larutan B dan C, ditetapkan dengan menggunakan
persamaan uji di atas.
Uji ini harus diulang apabila terjadi perubahan
kondisi yang dapat mempengaruhi hasil uji. Uji
dinyatakan absah apabila larutan A dan D
memberikan hasil negatif, dan hasil larutan C sesuai
dengan kepekaan yang tertera pada etiket.
Jika kepekaan lysate yang diperoleh dalam larutan
uji pada larutan B tidak kurang dari 0,5 dan tidak
Tabel 1 Penyiapan Larutan untuk Uji Penghambatan/Pemacuan Cara Jendal Gel
Larutan Konsentrasi endotoksin/Larutan yang Pengencer
ditambah endotoksin
Aa 0 / larutan sampel ----
Bb 2/ larutan sampel larutan sampel
Cc 2/air untuk uji endotoksin bakteri Air Pereaksi
LAL
lebih dari 2, maka larutan uji tidak mengandung
faktor pengganggu pada kondisi uji yang digunakan.
Jika sebaliknya, berarti terdapat faktor penggangu.
Jika sampel yang diuji tidak memberikan hasil yang
sesuai pada pengenceran yang digunakan ,ulangi uji
menggunakan pengenceran yang lebih besar, tetapi
tidak boleh melebihi PMA. Bila digunakan lysate
yang lebih peka, maka pengenceran sampel lebih
besar, dan dalam hal ini dapat mengurangi
pengganggu.
Gangguan dapat diatasi dengan penanganan yang
sesuai misalnya penyaringan, netralisasi, dialisis, atau
pemanasan. Untuk memastikan bahwa penanganan
yang dipilih efektif menghilangkan gangguan tanpa
menghilangkan endotoksin, lakukan pengujian di
bawah ini menggunakan sediaan uji dengan
penambahan BPE sesuai dengan perlakuan yang
dipilih.
Uji Batas Jendal Gel
Uji ini dilakukan bila dalam monografi disebutkan
batas endotoksin.
Prosedur Siapkan larutan A, B, C dan D seperti
tertera pada Tabel 2 dan lakukan pengujian larutan ini
mengikuti prosedur Uji Konfirmasi Kepekaan
Pereaksi LAL, yang dijelaskan dalam Uji Persiapan
Cara Jendal Gel.
Interpretasi Uji absah jika kedua replikasi kontrol
positif larutan B dan C memberikan hasil positif dan
kedua kontrol negatif larutan D adalah negatif.
Sediaan uji memenuhi syarat jika diperoleh hasil
negatif pada kedua tabung reaksi yang berisi larutan
A, dan tidak memenuhi syarat jika diperoleh hasil
positif pada dua tabung.
Ulangi pengujian jika diperoleh hasil positif pada
satu tabung reaksi berisi larutan A dan hasil negatif
pada tabung lainnya. Sediaan uji memenuhi syarat
jika diperoleh hasil negatif pada kedua tabung reaksi
pada pengujian ulang. Jika pengujian positif untuk
sediaan uji dengan pengenceran lebih kecil dari PMA,
pengujian dapat diulang dengan pengenceran tidak
melebihi PMA.
Faktor Kadar endotoksin Jumlah
pengencer awal replikasi
---- ---- 4
1 2 4
2 1 4
4 0,5 4
8 0,25 4
1 2 2
2 1 2
 - 1893 -

Larutan Konsentrasi endotoksin/Larutan yang Pengencer Faktor Kadar endotoksin Jumlah

ditambah endotoksin pengencer awal replikasi
4 0,5 2
8 0,25 2
Dd 0/Air Pereaksi LAL ---- ---- ---- 2
a Larutan A : larutan sampel dari sediaan uji yang bebas endotoksin
b Larutan B : Uji faktor pengganggu
c Larutan C : Kontrol kepekaan pereaksi LAL sesuai etiket
d Larutan D : Kontrol negatif air pereaksi LAL

Tabel 2. Penyiapan Larutan untuk Pengujian

Batas Pembentukan Jendal Gel Penetapan Kadar Endotoksin Bakteri dengan
Larutan*
Kadar Endotoksin/Larutan yang Jumlah Cara Jendal Gel
ditambah endotoksin replikasi
A 0/ larutan sampel yang diencerkan 2 Penetapan kadar ini menghitung jumlah endotoksin
B 2/ larutan sampel yang diencerkan 2 bakteri dalam larutan sampel dengan cara titrasi
C 2/air pereaksi LAL 2 hingga titik akhir.
D 0 / air pereaksi LAL 2
*Siapkan larutan A dan kontrol positif produk larutan B dengan
pengenceran tidak melebihi PMA dan lakukan seperti yang tertera
Prosedur Siapkan larutan A,B,C dan D seperti tertera
pada uji faktor pengganggu teknik pembentukan jendal gel, dalam pada Tabel 3 dan uji larutan ini mengikuti prosedur
Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel. Kontrol positif larutan B dan Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL, tertera dalam
C mengandung endotoksin baku dengan konsentrasi dua kali Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel.
kepekaan pereaksi LAL yang tercantum pada etiket. Kontrol
negatif, larutan D, adalah Air Pereaksi LAL

Tabel 3 Penyiapan Larutan untuk Penentuan Kadar Pembentukan Jendal Gel

Kadar endotoksin/
Faktor Kadar endotoksin Jumlah
Larutan Larutan dengan Pengencer
pengencer awal replikasi
penambahan endotoksin
1 - 2
Aa 0 / larutan sampel air pereaksi LAL 2 - 2
4 - 2
8 - 2
Bb 2/ larutan sampel - 1 2 2
1 2 2
Cc 2/air pereaksi LAL air pereaksi LAL 2 1 2
4 0,5 2
8 0,25 2
Dd 0 / air pereaksi LAL - - - 2
a Larutan A : larutan sampel pada pengenceran tidak lebih dari PMA yang pengujian terhadap faktor pengganggu pembentukan

jendal gel telah dilakukan. Pengenceran sampel berikutnya tidak lebih dari PMA. Gunakan air pereaksi LAL untuk membuat
seri pengenceran dalam empat tabung berisi larutan sampel yang diuji dengan kadar 1, ½, ¼, dan 1/8, relatif terhadap
pengenceran yang pengujian terhadap faktor pengganggu telah dilakukan. Pengenceran lainnya dapat digunakan bila sesuai.
b Larutan B : Larutan A mengandung endotoksin baku pada kadar 2 (kontrol positif produk)
c Larutan C : Dua seri dari 4 tabung air pereaksi LAL mengandung endotoksin baku dengan kadar berturut-turut 2, , 0,5

dan 0,25.
d Larutan D : Air pereaksi LAL (kontrol negatif).
 - 1894 -
Perhitungan dan Interpretasi Uji absah jika
kondisi berikut dipenuhi: (1) Kedua replikasi dari
kontrol negatif larutan D adalah negatif; (2)Kedua
replikasi dari kontrol positif larutan B adalah positif;
(3) Rata-rata geometrik kadar titik akhir larutan C
berada dalam rentang 0,5 - 2.
Untuk menentukan kadar endotoksin dalam larutan
A, hitung kadar titik akhir setiap seri replikasi dari
pengenceran dengan mengalikan tiap faktor
pengenceran titik akhir dengan . Kadar endotoksin
dalam sampel adalah rata-rata geometrik kadar titik
akhir replikasi (lihat rumus yang diberikan dalam Uji
Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL, yang dijelaskan
dalam Uji Persiapan untuk Cara Jendal Gel). Jika
pengujian dilakukan dengan mengencerkan larutan
sampel, hitung kadar endotoksin dalam sampel awal
dengan mengalikannya dengan faktor pengenceran.
Jika tidak ada pengenceran sampel yang positif dalam
pengujian absah, laporkan kadar endotoksin kurang
dari  (jika enceran sampel yang diuji kurang dari 
dikalikan faktor pengenceran terkecil dari sampel).
Jika semua pengenceran positif, kadar endotoksin
dilaporkan sama atau lebih besar dari faktor
pengenceran terbesar dikalikan . (Misalnya: Faktor
pengenceran awal 8 kali  pada Tabel 3).
Bahan memenuhi syarat jika kadar endotoksin
kurang dari nilai yang dinyatakan dalam masing-
masing monografi.
CARA FOTOMETRIK
Metode turbidimetri mengukur peningkatan
kekeruhan. Berdasarkan prinsip pengujian yang
digunakan, teknik ini diklasifikasikan menjadi
turbidimetri titik akhir dan turbidimetri kinetik. Cara
turbidimetri titik akhir didasarkan pada hubungan
kuantitatif antara kadar endotoksin dan kekeruhan
(serapan atau transmisi) dari campuran reaksi pada
akhir masa inkubasi. Cara turbidimetri kinetik dapat
dilakukan dengan dua cara: mengukur waktu yang
dibutuhkan untuk mencapai nilai serapan yang telah
ditetapkan atau kecepatan pembentukan kekeruhan.
Metode kromogenik mengukur kromofor yang
dilepaskan dari peptida kromogenik yang sesuai, yang
dihasilkan dari reaksi antara endotoksin dengan
pereaksi LAL. Berdasarkan prinsip pengujian yang
digunakan, teknik ini diklasifikasikan sebagai teknik
kromogenik titik akhir atau kromogenik kinetik. Cara
kromogenik titik akhir didasarkan pada hubungan
kuantitatif antara kadar endotoksin dan pelepasan
kromofor pada akhir masa inkubasi. Cara kromogenik
kinetik dapat dilakukan dengan mengukur waktu yang
dibutuhkan untuk mencapai nilai serapan yang telah
ditentukan atau kecepatan pembentukan warna.
Seluruh pengujian fotometrik dilakukan pada suhu
inkubasi yang direkomendasikan oleh produsen
Pereaksi LAL, umumnya 37  1.
Uji Persiapan Cara Fotometrik
Untuk menjamin presisi atau keabsahan dari cara
turbidimetri dan kromogenik, dilakukan uji persiapan
untuk memverifikasi kriteria kurva baku yang absah
dan larutan sampel tidak menghambat atau memacu
reaksi. Revalidasi metode pengujian diperlukan bila
terjadi perubahan kondisi yang dapat berpengaruh
terhadap hasil uji.
Verifikasi Kriteria Kurva Baku - Dengan
menggunakan larutan endotoksin baku, siapkan
minimal 3 kadar endotoksin untuk membuat kurva
baku. Lakukan pengujian menggunakan minimal 3
replikasi untuk masing-masing kadar endotoksin
baku, sesuai instruksi produsen pereaksi LAL
(perbandingan volume, waktu inkubasi, suhu, pH,
dan lain-lain). Jika rentang yang diinginkan dalam
metode kinetik lebih besar dari 2 log, maka harus
dimasukkan larutan baku tambahan, agar setiap
kenaikan log tetap berada dalam rentang kurva baku.
Nilai absolut dari koefisien korelasi, │r│, harus lebih
besar atau sama dengan 0,980 untuk rentang kadar
endotoksin sebagaimana ditetapkan oleh produsen
pereaksi LAL.
Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Fotometrik
Pilih satu kadar endotoksin pada atau di sekitar
pertengahan kurva baku endotoksin. Siapkan larutan
A, B, C dan D seperti yang tertera pada Tabel 4.
Lakukan uji terhadap larutan A, B, C dan D minimal
duplo sesuai instruksi untuk Pereaksi LAL yang
digunakan (volume sampel dan pereaksi LAL,
perbandingan volume sampel dengan pereaksi LAL,
waktu inkubasi, dan lain-lain).
Rata-rata perolehan kembali endotoksin yang
ditambahkan adalah kadar endotoksin total dalam
larutan dikurangi kadar endotoksin dalam larutan
semula (jika ada). Agar dapat dinyatakan bebas dari
faktor pengganggu pada kondisi pengujian, hasil
pengukuran kadar endotoksin yang ditambahkan pada
sampel harus berada diantara 50%-200% dari kadar
endotoksin yang ditambahkan .
Bila perolehan kembali endotoksin berada di luar
rentang yang ditetapkan maka faktor pangganggu
harus dihilangkan dengan melakukan Uji Faktor
Pengganggu untuk Cara Jendal Gel sebagaimana
yang dijelaskan dalam Uji Persiapan Cara Jendal Gel.
Ulangi Uji Faktor Pengganggu untuk Cara Jendal
Gel untuk memvalidasi perlakuan.
Prosedur Cara Fotometrik
Lakukan prosedur seperti yang tertera pada Uji
Faktor Pengganggu untuk Cara Fotometrik dalam
Uji Persiapan Cara Fotometrik.
Perhitungan Untuk Cara Fotometrik
 - 1895 -

Hitung kadar endotoksin dari tiap-tiap replikasi B yang serupa; pengujian serupa dilakukan
larutan uji A, menggunakan kurva baku yang dibuat menggunakan sel O sebagai kontrol negatif. Jika
dengan kontrol positif larutan C. Uji dinyatakan umur serum lebih dari 24 jam, tambahkan 1 bagian
absahjika kondisi berikut dipenuhi: (1) Hasil kontrol volume serum golongan O segar bebas lisin ke dalam
positif larutan C memenuhi persyaratan validasi yang tiap tabung sebagai sumber komplemen. Campur isi
ditetapkan pada Verifikasi Kriteria Kurva Baku dalam tiap tabung, inkunbasi pada suhu 37º selama 1 jam dan
Uji Persiapan Cara Fotometrik; (2) Perolehan amati hemolisis dalam beningan.
kembali endotoksin, dihitung dari konsentrasi Terhadap serum yang memberikan reaksi positif
endotoksin larutan B setelah dikurangi konsentrasi dalam uji tersebut lakukan pengujian lebih lanjut
endotoksin larutan A, berada pada rentang 50% – sebagai berikut:
200%; dan (3) Hasil kontrol negatif larutan D tidak Encerkan 1 bagian volume serum dengan 3 bagian
melebihi batas nilai blangko yang dipersyaratkan volume larutan natrium klorida P 0,9% dan campur 1
dalam uraian pereaksi LAL yang digunakan. bagian volume serum encer dengan 1 bagian volume
serum golongan O segar bebas lisin dan 1 bagian
Penafsiran Hasil Cara Fotometrik volume suspensi sel A1 atau sel B 10% dalam larutan
natrium klorida P 0,9% (yang mengalami lisis pada
Pada pennetapan kadar secara fotometrik, sediaan uji sebelumnya). Pada waktu yang bersamaan, dalam
uji memenuhi syarat jika rata-rata kadar endotoksin 2 tabung lain, campur 1 bagian volume larutan
dari replikasi larutan A, setelah koreksi pengenceran natrium klorida P 0,9% dengan 1 bagian volume
dan kadar, lebih kecil dari batas endotoksin produk. serum golongan O secara segar bebas lisin. Ke dalam
salah satu tabung ini tambahkan 1 bagian volume
Tabel 4. Penyiapan Larutan untuk Uji suspensi sel A1, 10% dalam larutan natrium klorida P
Penghambatan/Pemacuan Cara Fotometrik 0,9% dan ke dalam tabung lainnya 1 bagian volume
Larutan Kadar Larutan yang Jumlah suspensi sel B 10% dalam larutan natrium klorida P
endotoksin ditambah replika 0,9%. Inkubasi semua tabung pada suhu 37º selama 1
endotoksin jam, campur isi masing- masing tabung dan amati
Aa 0 Larutan Tidak hemolisis dalam beningan. Tidak terbentuk hemolisis
sampel kurang
dalam tiap tabung.
dari 2
Bb kadar tengah Larutan Tidak
pada kurva sampel kurang
baku dari 2 UJI HISTAMIN <221>
Cc Minimal 3 Air Pereaksi Masing-
kadar (kadar LAL masing Bunuh marmut dengan bobot tubuh 250 g hingga
terendah sama tidak 350 g yang telah dipuasakan selama 24 jam. Potong
dengan ) kurang usus halus bagian distal sepanjang 2 cm dan kosong-
dari 2
kan dengan membilas hati-hati dengan Larutan B
Dd 0 Air Pereaksi Tidak
menggunakan alat suntik. Ikat dengan benang halus
LAL kurang
dari 2 kedua ujungnya dan buat potongan melintang kecil
a Larutan A : Larutan sampel, dapat diencerkan tidak pada bagian tengah potongan usus halus. Letakkan
lebih dari PMA dalam bejana organ dengan kapasitas 10 mL hingga
b Larutan B : Sediaan uji dengan pengenceran yang 20 mL berisi Larutan B, yang dipertahankan pada
sama dengan Larutan A mengandung endotoksin yang suhu tetap (34° sampai 36°) dan larutan dialiri udara
ditambahkan sehingga kadar yang sama dengan/mendekati atau campuran oksigen P - karbon dioksida P(95:5).
kadar tengah kurva baku. Ikatkan salah satu benang dekat pada dasar bejana
c Larutan C : Larutan baku Endotoksin baku dengan organ. Ikatkan benang yang lain pada miograf
kadar sebagaimana yang digunakan dalam validasi metode
isotonik dan rekam kontraksi organ pada kimograf
seperti yang tertera pada Verifikasi Kriteria Kurva Baku
dalam Uji Persiapan untuk Cara Fotometrik (seri kontrol atau alat lain yang sesuai yang dapat memberikan
positif). rekaman permanen. Jika digunakan pengungkit,
d Larutan D : Air Pereaksi LAL (kontrol negatif). panjangnya harus sedemikian rupa sehingga gerakan
organ diperkuat lebih kurang 20 kali. Tegangan usus
halus sebaiknya 9,8 mN dan disesuaikan dengan
kepekaan organ. Bilas bejana organ dengan Larutan
UJI HEMOLISIN <211>
B. Biarkan selama 10 menit. Bilas dua atau tiga kali
lagi dengan Larutan B. Tambahkan 0,2 mL hingga
Tambahkan 1 bagian volume serum donor segar ke
0,5 mL larutan histamin dihidroklorida P yang diukur
dalam 1 bagian volume suspensi sel A1 10% dalam
tepat, yang menimbulkan respons submaksimal yang
larutan natrium klorida P 0,9% dan tambahkan 1
reprodusibel. Dosis ini dinyatakan sebagai “dosis
bagian volume kedalam 1 bagian volume suspensi sel
tinggi”. Bilas bejana organ (sebaiknya dengan air