Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Limulus Amebocyte Lysate (LAL) diperoleh dari ekstrak air amebosit dalam kepiting

g ladam kuda, Limulus polyphemus, dan dibuat khusus sebagai pereaksi LAL untuk pembentukan jendal-gel, Penetapan titik akhir reaksi dilakukan dengan membandingkan langsung enceran dari zat uji dengan enceran endotoksin baku, dan jumlah endotoksin dinyatakan dalam unit endotoksin (UE).

Prosedur: 1. Baku Pembanding Endotoksin (BPE) Merupakan Endotoksin BPFI yang telah diketahui potensinya dalam unit Endotoksin per vial. Konstitusi seluruh isi vial BPE dengan 5,0 ml air pereaksi LAL (air pereaksi LAL adalah air untuk injeksi atau air lain yang tidak berekasi dengan pereaksi LAL yang digunakan pada batas kepekaan pereaksi. Campur dengan penfocok vorteks sekali-sekali selama 30 menit. Gunakan larutan pekat ini untuk membuat seri pengenceran yang sesuai. Simpan larutan pekat dalam lemari pendingin, tidak lebih dari 14 hari untuk membuat enceran berikutnya. Kocok kuat dengan pengocok vorteks selama tidak kurng dari 3 menit sebelum digunakan. Campur setiap enceran tidak kurang dari 30 detik sebelum membuat pengenceran berikutnya. Enceran tidak boleh disimpan karena hilangnya aktivitas pada penyerapan, bila belum ada data penunjang tentang hal ini. 2. Baku Endotoksin Kontrol (BEK) Merupakan sediaan endotoksin uang telah dibakukan terhadap BPE. Lakukan pembakuan pada tiap bets baru BEK, sebelum digunakan dalam pengujian. Kalibrasi BEK terhadap BPE harus dengan prosedur uji dan bets khusus pereaksi LAL yang akan digunakan. Pembakuan BEK terhadap BPE menggunakan pereaksi LAL untuk prosedur jendal-gel dilakukan penetepan dari sekurang-kurangnya 1 vial BEK dan 1 vialBPE, seperti yang tertera pada prosedur uji, menggunakan 4 tabung reaksi pada tiap aras seri enceran BPE dan 4 tabung reaksi yang pada tiap aras seri enceran BEK. Antilog dari perbedaan antara rata-rata log akhir titik BPE dan rata-rata log titik akhir BEK adalah potensi BEK yang telah dibakukan yang dikonversikan dan dinyatakan dalam unit Endotoksin per mg pada kondisi pengeringan yang ditetapkan untuk BEK, atau dalam unit Endotoksin per wadah yang sesuai. BEK yang sesuai mempunyai potensi tidak kurang dari 2 UE per ng dan tidak lebih dari 50 UE per ng.

3. Penyiapan uji Gunakan pereaksi LAL yang mencantumkan kepekaannya pada etiket. Bebaskan tiap wadah atau peralatan yang digunakan dari endotoksin permukaan yang mungkin ada dengan cara memanaskan dalam oven pada suhu 250C atau lebih selama waktu yang diperlukan. Validitas hasil uji untuk endotoksin bakteri ini memerlukan pembuktiaan yang cukup bahwa spesimen bahan atau larutan pencuci atau ekstrak yang digunakan pada uji, tidak menghambat atau memacu reaksi atau dengan kata lain akan mengganggu pengujian. Validasi dilakukan dengan melakukan uji Penghambatan atau Pemacuan seperti di bawah ini termasuk kontrol negatif yang sesuai. Validasi diulangi jika sumber pereaksi LAL atau metode pembuatan atau formulasi bahan berubah. 4. Uji konfrimasi kepekaan pereaksi LAL Lakukan konfirmasi kepekaan yang tertera pada etiket menggunakan tidak kurang dari 1 vial untuk setiap lot pereaksi LAL. Buat seri pengenceran kelipatan 2 dari BPE (atau BEK) hingga kadar 2; ; 0,5; 0,25 adalah kepekaan dari pereaksi LAL dalam unit Endotoksin FI per ml yang tertera pada etiket. Lakukan uji pada 4 kadar larutan baku, dalam 4 replikasi dan kontrol negatif. Kadar rata-rata geometrik titik akhir seperti yang tertera pada Perhitungan dan Penafsiran hasil, harus lebih besar atau sama dengan 0,5 dan lebih kecil atau sama dengan 2,0. Lakukan konfirmasi pengujian kepekaan yang tertera dalam etiket untuk setiap lot baru dari peraksi LAL sebelum digunakan dalam pengujian. 5. Uji Penghambatan atau Pemacuan Lakukan pengujian pada alikot spesimen atau enceran yang tidak melebihi Pengenceran Maksimum yang Absah, yang tidak ditemukan endotoksin. Lakukan uji pada spesimen tanpa penambahan endotoksin dan dengan penambahan endotoksin, hingga kadar akhir 2; ; 0,5; 0,25. Lakukan pengujian seperti yang tertera pada Prosedur Uji, tetapi menggunakan tidak kurang dari 4 tabung replikasi spesimen tanpa perlakuan dan untuk tiap spesimen yang telah ditambah endotoksin. Pada saat yang bersamaan, lakukan pengujian endotoksin dalam air dengan kadar yang sama seperti di atas dan kontrol negatif masing-masing dalam 2 replikasi. Hitung rata-rata geometrik kadar endotoksin titik akhir untuk spesimen seperti yang tertera pada Perhitungan dan Penafsiran hasil. Pengujian basah jika ratarata geometrik kadar titik akhir dalam spesimen lebih besar atau sama dengan 0,5 dan lebih kecil atau sama dengan 2,0. Jika hasil yang diperoleh dari spesimen uang ditambah endotoksin di luar batas-batas yang telaah ditetapkan, bahan tidak sesuai untuk Uji Endotoksin Bakteri. Ulangi uji penghambataan dan pemacuan setelah netralissai, inaktivasi atau menghilangkan zat mengganggu atau setelah zat uji diencerkan

dengan faktor tidak melebihi Pengenceran Maksimum yang Absah. Gunakan pengenceran secukupnya tidak lebih dari Pengenceran Maksimum yang Absah untuk menghilangkan penghambatan atau pemacuan endotoksin yang ditambahkan untuk penetapan kadar endotoksin selanjutnya dalam spesimen uji. Jika endotoksin endogen terdeteksi dalam spesimen yang tidak mengalami perlakuan dalam kondisi pengujian, bahan tidak sesuai, untuk Uji Penghambatan atau Pemacuan atau dapat menhadi sesuai dengan menghilangkan endotoksin yang ada dengan penyaringan ultra atau pengenceran yang sesuai. Encerkan spesimen yang tidak mengalami perlakuan (yang dikonstitusi, jika diperlukan untuk pemberian atau pemakaian), hingga batas tidak melebihi pengenceran maksimum yang absah, yang menunjukkan endotoksin tidak terdeteksi. Ulangi Uji Penghambatan atau Pemacuan menggunakan spesimen pada pengenceran tersebut. 6. Pengenceran Maksimum yang Absah (PMA) Pengenceran maksimum yang absah sesuai untuk injeksi atau larutan dengan pemberian parenteral dalam bentuk terkonstitusi atau diencerkan pada pemberian, atau jika diperlukan untuk jumlah obat dalam bobot bervariasi. Bila batas kadar endotoksin dalam monogradi dinyatakan dalam volume (dalam UE per ml), maka memperoleh faktor PMA, batas kadar dibagi dengan kepekaan, (dalam UE per ml) dari pereaksi LAL yang digunakan untuk penetapan. Bila batas kadar endotoksin dalam masing-masing monografi dinyatakan dalam bobot atau unit dari zat aktif (dalam UE per mg atau UE per unit), kalikan batas kadar endotoksin dengan kadar (dalam mg per ml atau dalam unit per ml) obat dalam larutan uji atau larutan terkonstitusi sesuai dengan petunjuk pada etiket, bila diperlukan, dan bagi hasil perkalian dengan hingga diperoleh faktor PMA. Faktor PMA yang diperoleh adalah faktor batas pengenceran untuk penyiapan uji yang absah. 7. Prosedur Uji Pada penyiapan dan pelaksanaan pengujian, perlakuan terhadap spesimen harus diperhatikan untuk mencegah kontaminasi mikroba. Untuk menghitung jumlah endotoksin dalam spesimen, penetapan kadar dilakukan dengan seri pengenceran spesimen dengan kadar menurun. Pilih pengenceran yang sesuai dengan seri geometrik segungga setiap tahap lebih besar dari tahap berikutnya dengan perbandingan yang tetap. Termasuk di dalamnya kontrol negatif, kontrol positif dan kontrol sediaan positif. Gunakan tidak kurang dari 2 replikasi tabung reaksi untuk setiap seri pengenceran untuk setiap spesimen uji. Lakukan dengan cara yang sama dan waktu yang sama terhadap satu seri pengenceran baku endotoksin yang tidak kurang dari 2 replikasi tabung reaksi. Seri pengenceran baku endotoksin dimasukkan dalam setiap blok tabung, yang terdiri dari sejumlah rak yang diinkubasikan bersama-sama, sehingga kondisi dalam blok sama.

8. Penyiapan Oleh karena bentuk dan jumlah baku endotoksin dan pereaksi LAL dalam tiap wadah dapat beragam, konstitusi dan atau penegenceran isi harus sesuai dengan yang tertera pada etiket. Kecuali dinyatajan lain dalam masing-masing monografi, pH dari campuran spesimen dan pereaksi LAL adala pada rentang 6,0 hingga 8,0. Atur pH dengan penambahan natrium hidroksida tau asam klorida atau dapar yang sesuai, steril dan bebas endotoksin pada spesimen, sebelum pengujian. 9. Prosedur Masukkan ke dalam tabung reaksi 10 mm x 75 mm atau vial uji tunggal, sejumlah volume yang telah ditentukan dari kontrol negatif, kadar baku endotoksin, spesimen, dan kontrol sediaan positif. Kontrol sediaan positif berisi bahan atau larutan pencuci atau ekstrak yang telah ditambah BPE atau BEK yang dibakukan hingga kadar endotoksin 2. Tambahkan pereaksi LAL yang telah dikonstitusi, kecuali digunakan vial uji tunggal. Campur spesimen/campuran pereaksi LAL, inkubasi dalam tangas air atau blok pemanas dan catat waktu mulai inkubasi tiap tabung dengan tepat. Inkubasi masing-masing tabung selama 60 menut 2 menit pada suhu 37C 1C, tidak boleh ada gangguan, dan secara hati-hati diangkat untuk diamati. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya gel yang stabil dan akan tetap melekat pada dasar tabung bila dibalikkan 180, catat hasil tersebut sebagai positif (+). Reaksi negatif ditandai dengan tidak terbentuknya gel yang stabil dan akan terlepas dari dasar tabung bila dibalikkan 180, catat hasil tersebut sebagai positif (-). Pegang tabung dengan hati-hati hindari terjadinya getaran, bila tidak demikian kemungkinan akan diperoleh hasil negatif palsu. Pengujian tidak absah jika kontrol sediaan positif memberikan hasil negatif (-) atau baku endotoksin tidak menunjukkan titik akhir pada pengenceran dalam kelipatan dua dari kepekaan yang tertera pada etiket pereaksi LAL atau juka ada kontrol negatif yang memberikan hasil positif. Lakukan Perhitungan Kadar Endotoksin untuk menetapkan jumlah endotoksin yang ada dalam spesimen uji. 10. Perhitungan dan Penafsiran Hasil a. Perhitungan Rata-rata Geometrik Titik akhir adalah uji positif yang terakhir dalam suatu seri kadar yang menutun dari endotoksin, spesimen atau spesimen yang telah ditambah endotoksin. Catat kadar titik akhir (E), untuk replikasi seri pengenceran. Tetapkan logaritma kadar titik akhir (e), dan hitung rumus rata-rata geometrik kadar titik akhir dimana e adalah jumlah logaritma kadar titik akhir dari seri pengenceran yang digunakan; dan f adalah jumlah replikasi. dengan rumus:

b. Perhitungan Kadar Endotoksin Hitung kadar endotoksin (dalam unit per ml atau unit per g atau mg) dalam atau pada bahan uji. Mula-mula hitung kadar titik akhir (E), untuk tiap seri pengenceran dengan mengalikan dengan kebalikan faktor pengenceran titik akhir. adalah kepekaan dalam unit endotoksin per ml yang tertera pada etiker dari pereaksi LAL yang digunakan dalam pengujian, Kadar titik akhir geometrik bahan uji adalah antilog elf; e adalah logaritma kadar titik akhir; dan f adalah jumlah replikasi tabung reaksi yang dibaca pada aras spesimen uji. c. Penafsiran Hasil Bahan memenuhi syarat uji jika kasar endotoksin tidak lebih dari yang ditetapkan pada masing-masing monografi.