STUDI KASUS FARMASI INDUSTRI

UJI ENDOTOKSIN PADA SEDIAAN INJEKSI

Dosen Pengampu :

Dr. apt. Ismi Rahmawati, S.Si., M.Si.

Disusun Oleh :

Nurul Aulia Zahara (2320455110)

Ramdahan Dicky Saputera (2320455111)

PROGRAM STUDI PROFESI APOTEKER

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SETIA BUDI

SURAKARTA

2023
 Kasus 2

Industri Farmasi USB Farma memproduksi sediaan steril injeksi ranitidin 150 mg/6mL dalam
bentuk vial. QC Mikrobiologi melakukan uji endotoksin dengan cara tjendal gel. Pengujian
menggunakan Reagen yang digunakan adalah Limulus Amebocyte Lysate, dengan kepekaan
pereaksi (ʎ) = 0,125 EU/mL. CSE dengan pereaksi (ʎ)=500 EU/mL direkonstitusi dengan 5 mL
LRW

Tugas:

1. Jelaskan batas endotoksin yang diperbolehkan berdasarkan monografi

FarmakopeIndonesia ed VI?
Jawaban :

Uji endotoksin bakteri adalah uji untuk mendeteksi atau mengkuantisasi endotoksin
bakteri yang mungkin terdapat dalam sampel yang diuji. Pengujian dilakukan menggunakan
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) yang diperoleh dari ekstrak air amebosit dalam kepiting
ladam kuda (Limulus polyphemus atau Tachypleus tridentatus) dan dibuat khusus sebagai
pereaksi LAL. Batas endotoksin yang diperbolehkan berdasarkan monografi FI ed VI tidak
lebih dari 7,0 unit Endotoksin FI per mg ranitidin.

2. Buat Prosedur untuk pengujian uji konfirmasi kepekaan lisat sesuai dengan FI edisi 6,
beserta form pengujiannya.
Jawabn :
Injeksi ranitidine dengan sediaan lazim 150 mg/6Ml (25mg)
- LAL kepekaan pereaksi (ʎ) = 0,125 EU/mL (larutan uji)
- PMA = (7 x 25mg)/0,125= 1.400
- CSE dengan pereaksi (ʎ)=500 EU/mL direkonstitusi dengan 5 mL LRW
= 500/5 EU/ml
= 100 EU/ml
CSE= 100/0,125= 800 λ
- Pengenceran 800 λ >>> 8 λ
V1.C1=V2.C2
V1. 800 λ = 2ml .8 λ
 = 0,02>>> 20 µL
- LRW = 2ml – 20 µL
= 2000 µL- 20 µL
= 1980µL

Lakukan konfirmasi kepekaan pereaksi yang tertera pada etiket menggunakan tidak
kurang dari 1 vial untuk setiap lot pereaksi LAL. Buat pengenceran seri kelipatan 2 dari BPE
dalam Air Pereaksi LAL (LRW) hingga konsentrasi 2λ ;1 λ ; 0,5λ ; dan 0,25 λ .adalah
kepekaan pereaksi LAL yang tertera pada etiket (UE/mL). Lakukan uji pada 4 konsentrasi
larutan baku, dalam 4 replikasi termasuk kontrol negatif.

Campur pereaksi LAL dengan larutan baku dari masing-masing konsentrasi dalam
tabung uji dengan volume yang sama (0,1 mL). Inkubasi campuran reaksi dalam waktu yang
tetap sesuai dengan petunjuk produsen pereaksi LAL (biasanya 37±1°C, selama 60±2 menit),
hindari getaran. Untuk menguji integritas gel, ambil setiap tabung langsung dari inkubator
dan balikkan 180° secara perlahan-lahan. Jika telah terbentuk gel yang kuat, yang tetap di
tempatnya walaupun telah dibalik, catat sebagai hasil positif. Jika gel tidak terbentuk atau gel
yang terbentuk jatuh ketika dibalik, maka hasil dinyatakan negatif. Uji dinyatakan absah, jika
larutan baku konsentrasi terendah memberikan hasil negatif pada semua replikasi uji.

Titik akhir adalah konsentrasi terendah yang masih memberikan hasil positif dari
satu pengenceran seri. Hitung nilai rata-rata dari logaritma konsentrasi titik akhir, e, dan
hitung antilogaritma dari nilai rata rata menggunakan rumus berikut: Rata-rata geometrik
konsentrasi titik akhir = antilog (Ʃe/f)
 Keterangan :

- Ʃe : jumlah logaritma konsentrasi titik akhir dari pengenceran seri yang digunakan
- f : jumlah replikasi.

Rata-rata geometri konsentrasi titik akhir adalah hasil pengukuran kepekaan

pereaksi LAL (UE/mL). Jika hasil pengukuran kepekaan tidak kurang dari 0,5 dan tidak
lebih dari 2, maka kepekaan yang tercantum di etiket sesuai dan dapat digunakan dalam
pelaksanaan pengujian dengan lysate.

3. Buat Prosedur untuk pengujian uji faktor pengganggu sesuai dengan FI edisi 6, beserta
form pengujiannya.
Jawabn :

Siapkan larutan A, B, C, dan D seperti tertera pada Tabel 1 dan lakukan uji
penghambatan atau pemacuan pada larutan sampel yang diencerkan kurang dari PMA, tidak
mengandung endotoksin, dan ikuti prosedur dalam Uji Konfirmasi Kepekaan Pereaksi LAL
Rata-rata geometrik konsentrasi titik akhir dari larutan B dan C, ditetapkan dengan
menggunakan persamaan uji di atas. Uji ini harus diulang apabila terjadi perubahan kondisi
yang dapat mempengaruhi hasil uji. Uji dinyatakan absah apabila larutan A dan D
memberikan hasil negatif, dan hasil larutan C sesuai dengan kepekaan yang tertera pada
etiket.

Jika kepekaan lysate yang diperoleh dalam larutan uji pada larutan B tidak kurang
dari 0,5λ dan tidak lebih dari 2λ, maka larutan uji tidak mengandung faktor pengganggu pada
kondisi uji yang digunakan. Jika sebaliknya, berarti terdapat faktor penggangu. Jika sampel
 yang diuji tidak memberikan hasil yang sesuai pada pengenceran yang digunakan ,ulangi uji
menggunakan pengenceran yang lebih besar, tetapi tidak boleh melebihi PMA. Bila
digunakan lysate yang lebih peka, maka pengenceran sampel lebih besar, dan dalam hal ini
dapat mengurangi pengganggu. Gangguan dapat diatasi dengan penanganan yang sesuai
misalnya penyaringan, netralisasi, dialisis, atau pemanasan. Untuk memastikan bahwa
penanganan yang dipilih efektif menghilangkan gangguan tanpa menghilangkan endotoksin,
lakukan pengujian di bawah ini menggunakan sediaan uji dengan penambahan BPE sesuai
dengan perlakuan yang dipilih.

Larutan Konsentrasi Pengencer Faktor Kadar Jumlah

endotoksin/Larutan pengencer endotoksin replikasi
yang ditambah
endotoksin
A a
0 / larutan sampe ---- ---- ---- 4
Bb
2λ/ larutan sampel larutan sampel 1 2λ 4
2 1λ 4
4 0,5λ 4
8 0,25λ 4
C c
2λ/air untuk uji Air Pereaksi 1 2λ 2
endotoksin bakteri LAL 2 1λ 2

4. Buat Prosedur untuk pengujian sampel sesuai dengan FI edisi 6, beserta

formpengujiannya.

CARA UJI ENDOTOKSIN

“The gel-clot end poin test” (Uji penggumpalan gelatin)

1) Reagensia LAL dicampur dengan sampel larutan uji dalam tabung gelas masing-
masing dengan volume sama yaitu 1,0 ml.
2) Setelah dicampur, tabung gelas tersebut diinkubasi pada temperatur 37°C ± 2°C
selama 60 menit ± 1 menit.
3) Pembacaan pengujian larutan yaitu tabung gelas dari inkubator diambil dengan hati-
hati, kemudian membaliknya 180°, sehingga permukaan atas tabung berada di bagian
bawah.
 4) Hasil pembacaan adalah :
Positif ( + ) jika terbentuk gelatin pada yang tetap, berarti contoh larutan uji tersebut
mengandung sedikitnya sama dengan sensivitas Reagensia yang digunakan. Negatif
( - ) jika tidak terbentuk gelatin padat yang tetap, berarti bahwa contoh larutan uji
tersebut tidaj mengandung endotoksin atau lebih sedikit daripada sensivitas reagensia
yang digunakan.

Diketahui :
a. Larutan A : larutan sampel pada pengenceran tidak lebih dari PMA yang pengujian
terhadap faktor pengganggu pembentukan jendal gel telah dilakukan. Pengenceran
sampel berikutnya tidak lebih dari PMA. Gunakan air pereaksi LAL untuk membuat seri
pengenceran dalam empat tabung berisi larutan sampel yang diuji dengan kadar 1, ½, ¼,
dan 1/8, relatif terhadap pengenceran yang pengujian terhadap faktor pengganggu telah
dilakukan. Pengenceran lainnya dapat digunakan bila sesuai.
b. Larutan B : Larutan A mengandung endotoksin baku pada kadar 2 λ (kontrol positif
produk)
c. Larutan C : Dua seri dari 4 tabung air pereaksi LAL mengandung endotoksin baku
dengan kadar berturut-turut 2 λ, λ, 0,5 λ dan 0,25 λ.
d. Larutan D : Air pereaksi LAL (kontrol negatif).
5. Lakukan demo dan analisis dan interprestasi hasil pengujian sediaan yang diberikan
dalam kelas studi kasus.

6. Contoh hasil ( pelajari untukHasil uji akan dapat saat dikelas)