CARA UJI FECAL COLIFORM DENGAN METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

1. DISKUSI UMUM
1.1 Prinsip
Metode Most Probable Number (MPN) digunakan untuk menghitung bakteri Fecal
Coliform secara tidak langsung, dengan tingkat pengenceran tertentu. Suhu inkubasi yang
digunakan 44,50C ± 0,20C untuk Fecal Coliform selama 24 jam ± 2 jam. Adanya
pertumbuhan diketahui dari terjadinya fermentasi dengan menghasilkan gas dalam tabung
Durham dan terjadi turbiditas.

1.2 Ruang Lingkup

Metode Most Probable Number ini digunakan untuk menghitung bakteri Fecal Coliform
yang terdapat dalam air permukaan, mata air, air limbah, air limbah domestik dengan
tingkat pengenceran tertentu.

1.3 Gangguan
Jangan tempatkan contoh uji kontak langsung dengan es beku: sekat contoh uji
dengan bubble wrap atau sejenisnya. Simpan contoh uji dalam kondisi dingin tetapi tidak
beku (<100C) selama transportasi (< 8 jam antara pengambilan dengan sampai di lab).
Ketika kondisi transportasi tidak memungkinkan untuk menyerahkan contoh uji dalam
waktu 6 jam, pertimbangkan menggunakan fasilitas laboratorium yang lain dalam
pengambilan atau prosedur inkubasi tertunda.
Jika media telah didinginkan setelah sterilisasi, maka inkubasi semalaman pada suhu
kamar (200C) sebelum digunakan. Buang tabung yang menunjukkan pertumbuhan dan /
atau gelembung.

IK-39-1-PVM-TP, R: 1, Halaman: 1 dari 7

 1.4 Kontrol Kualitas (IQC)
1.4.1 Blanko Ruangan Kerja adalah kontrol yang dilakukan untuk memastikan tidak
adanya kontaminasi mikroorganisme (yang sedang diuji) di dalam ruangan kerja.
1.4.2 Blanko Pengenceran adalah kontrol yang dilakukan untuk memastikan tidak
adanya kontaminasi mikroorganisme (yang sedang diuji) di dalam larutan
pengencer.
1.4.3 Blanko Media adalah kontrol yang digunakan untuk memastikan tidak adanya
kontaminasi pada media tersebut.
1.4.4 Duplo contoh uji adalah pengujian contoh uji yang dilakukan berulang untuk
mengetahui seberapa dekat serangkaian pengukuran satu sama lain.
1.4.5 Kontrol Kultur Positif adalah kontrol yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri
target.

2. ACUAN
SM APHA Ed 24, 2023 9221 E.Thermotolerant (Fecal) Coliform Procedure.
SM APHA Ed 24, 2023 9221 C. Estimation of Bacterial Density.

3. PERALATAN
3.1 Botol contoh uji
3.2 Timbangan
3.3 Peralatan Persiapan Media
3.4 Tabung Reaksi
3.5 Cawan Petri
3.6 Tabung Durham
3.7 Rak Tabung
3.8 Autoclave
3.9 Inkubator
3.10 Ose bulat
3.11 Pipet, Mikropipet, dan Gelas Ukur
3.12 Laminar Air Flow

IK-39-1-PVM-TP, R: 1, Halaman: 2 dari 7

4. BAHAN
4.1 Media Lauryl Tryptose Broth
Gunakan media yang tersedia secara komersial dan ikuti petunjuk pabrikan yang tertera
pada kemasan media lauryl tryptose broth.
4.2 Media EC broth
Gunakan media yang tersedia secara komersial dan ikuti petunjuk pabrikan yang tertera
pada kemasan media EC Broth.
4.3 Media Les Endo Agar
Gunakan media yang tersedia secara komersial dan ikuti petunjuk pabrikan yang tertera
pada kemasan media Les Endo Agar

4.4 Larutan Pengencer (larutan buffer) (9050 C.1.a)

a. Larutan stok KH2PO4
Larutkan 34,0 gram KH2PO4 ke dalam 500 mL air aquadest, atur pH 7,2 ± 0,5 dengan
NaOH 1N, dan tanda bataskan hingga 1L dengan air aquadest. Sterilisasi dengan
autoclave. Simpan larutan stok dalam kondisi berpendingin dan buang jika terjadi
kekeruhan.
b. Larutan stok magnesium klorida
Larutkan magnesium klorida (38 g MgCl2 atau 81,1 g MgCl2. 6H2O) ke dalam 1 L air
aquadest. Sterilisasi dan simpan larutan stok dalam kondisi berpendingin dan buang
jika terjadi kekeruhan.
c. Larutan kerja
Tambahkan 1,25 mL larutan stok buffer fosfat dan 5,0 mL larutan stok magnesium
klorida ke dalam 1 L air aquadest. Tuang masing-masing 90 mL ± 10 mL atau 9 ± 1
mL setelah disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit. pH akhir seharusnya 7,2 ±
0,1. Catatan : nilai pH dapat berubah jika disimpan lama. Simpan dalam kondisi
berpendingin setelah membuka dan buang jika terjadi kekeruhan. Gunakan tidak lebih
dari 6 bulan.

5. PROSEDUR

IK-39-1-PVM-TP, R: 1, Halaman: 3 dari 7

 5.1 Tahap Penduga (Presumptive Phase)

Contoh uji diambil sebanyak 1 mL dengan mikropipet, kemudian dimasukkan ke dalam 9

ml buffer fosfat dikocok sampai homogen. Selanjutnya, beberapa tabung reaksi diisi
dengan 9 ml buffer fosfat yang digunakan untuk pengenceran dengan tingkatan tertentu.
Tiga pengenceran terakhir masing-masing diambil 1 mL ke dalam lima deretan tabung
yang berisi 10 mL media lauryl sulfate broth dimasing-masing pengenceran. Inkubasi
tabung yang telah diinokulasi pada suhu 35 ± 0,50C selama 24 ± 2 jam, jika tidak adanya
reaksi asam atau pembentukan gas maka inkubasi dilanjukan selama 24 ± 2 jam
berikutnya. Apabila tabung tidak ada reaksi asam atau pembentukan gas pada akhir 48 ±
3 jam inkubasi merupakan uji negatif. Tabung dengan reaksi dugaan positif dilanjutkan ke
Tahap Penegasan (Confirmed Phase).

5.2 Tahap Penegasan (Confirmed Phase)

Tabung dengan reaksi dugaan positif dari tahap penduga diinokulasi sebanyak 1-2 ose ke
dalam tabung yang berisi 10 mL media EC broth, lalu tabung dikocok perlahan sampai
homogen. Inkubasi tabung yang telah diinokulasi pada suhu 44,50C ± 0,2 0C selama 24 ±
2 jam, jika tidak ada reaksi asam atau pembentukan gas pada akhir 24 ± 2 jam inkubasi
merupakan uji negatif. Untuk memperkirakan kerapatan coliform, hitung nilai MPN dari
jumlah tabung EC broth positif.

6. CARA PENGISIAN REKAMAN HASIL PENGUJIAN

6.1 Tanda “+g” menunjukkan adanya produksi reaksi asam dan/atau pembentukan gas pada
tabung Durham.
6.2 Tanda “-” menunjukkan tidak adanya produksi reaksi asam dan / atau pembentukan gas
pada tabung Durham.
6.3 Tanda “*”menunjukkan inkubasi dilakukan selama 48 jam.

IK-39-1-PVM-TP, R: 1, Halaman: 4 dari 7

Gambar 1. Bagan Alur Pengujian Bakteri Fecal Coliform dalam Air
Metode Most Probable Number (MPN)

IK-39-1-PVM-TP, R: 1, Halaman: 5 dari 7

7. PERHITUNGAN
Tabel 1. Indeks MPN dan Tingkat Kepercayaan 95% untuk berbagai Kombinasi Hasil Positif
Ketika digunakan Lima Tabung per Dilusi (10 mL, 1.0 mL, 0.1 mL)

IK-39-1-PVM-TP, R: 1, Halaman: 6 dari 7

 Hasil positif ada dalam table MPN maka perhitungannya sebagai berikut:
10
𝑀𝑃𝑁/100𝑚𝐿 = 𝑇𝑎𝑏𝑒𝑙 𝑀𝑃𝑁/100𝑚𝐿𝑥 𝑉

Keterangan:
V = Volume bagian contoh uji pada pengenceran terendah
Jika hasil positif tidak ada dalam table MPN maka perhitungannya sebagai berikut:
𝑃 𝑥 100
𝑀𝑃𝑁/100𝑚𝐿 =
𝑁𝑥𝑇

Keterangan:
P = Jumlah hasil positif
N = Jumlah volume hasil negative
T = Total volume contoh uji dalam pengenceran

8. FORMULIR TERKAIT
FR-39-1.1-PVM-TP Rekaman Hasil Pengujian Fecal Coliform Metode Most Probable Number
(MPN) SM APHA 24th Ed, 9221 E dan 9221 C, 2023.

Disetujui Oleh : Diperiksa Oleh : Disusun oleh :

KOORDINATOR TEKNIS PENYELIA MIKROBIOLOGI PENGELOLA SAMPEL
PENGUJIAN

R. SOEHANA SOERYANI K, S.Si. FITRI ANNISA RIANDI S, S.Si AMALIA NURUL HUSAENI, S.Si
NIP. 197709022009012001 NIP. 198512022011012001

IK-39-1-PVM-TP, R: 1, Halaman: 7 dari 7