INSTRUKSI KERJA

Laboratorium Pengujian
Uji Daya Hambat Bahan Aktif terhadap Mikroorganisme Uji Secara Kualitatif dan Kuantitatif
BIOTEKNOLOGI

1. Tujuan
Instruksi Kerja ini bertujuan untuk menguraikan langkah-langkah kerja pengujian
daya hambat bahan antimikroba terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji secara
kualitatif dan kuantitatif..
2. Ruang lingkup
Instruksi Kerja ini berlaku untuk pengujian contoh dalam aktivitas daya hambat
suatu bahan terhadap mikroorganisme uji secara kualitatif maupun kuantitatif pada
Lab. Mikrobiologi-Laboratorium Pengujian Bioteknologi (LPB).
3. Rujukan
PR/5.4/1 : Pengujian
SNI ISO 20743:2011 : Tekstil - Penentuan aktivitas antibakteri produk yang
diproses penyempurnaan antibakteri.
4. Penanggung Jawab
Manajer Teknis
5. Rincian Kerja

Tabel 1. Daftar Media yang digunakan dalam pengujian

Media Nutrient Agar (NA)
Media Nutrient Broth (NB)

Tabel 2. Mikroba Uji yang dapat digunakan dalam pengujian

Mikroba Uji No Koleksi
Escherichia coli BTCC B 609 (= NBRC 3972 = ATCC 8739)
Escherichia coli BTCC B 614 (= NBRC 3301 = K12)
Staphylococcus aureus BTCC B 611 (= NBRC 13276 = ATCC 6538)

Tabel 3. Bahan Aus dan Peralatan yang harus dipersiapkan

Bahan Habis pakai Bahan Gelas dan lainnya Alat
1. Cawan petri disposable 1. Tabung reaksi 1. Pipet volumetrik
15 mm x 90 mm 2. Erlenmeyer/Botol media 2. pH meter
2. Corning tube 3. Gunting 3. Timbangan
3. Tips (10 ml, 1 ml, 200 4. Pinset 4. Magnetic stirer
l) 5. Jarum inokulasi (ose) 5. Pengocok tabung (vortex)
4. Kertas cakram steril 6. Pembakar bunsen 6. Inkubator (30C, 55C)
5. Tisu 7. Semprotan alkohol 7. Penangas air
6. Etanol 8. Batang gelas bengkok8. Autoklaf
7. Spiritus diameter 3-4 mm, panjang9. Lemari steril (clean bench)
tangkai 15-20 cm 10. Lemari pendingin (refrigerator)

Kode Dok: Terbitan ke: 1 Disetujui oleh: MT

Revisi ke: 0 Tanggal Terbit: 13.04.2015 Hal ke 1 dari 3
 INSTRUKSI KERJA
Laboratorium Pengujian
Uji Daya Hambat Bahan Aktif terhadap Mikroorganisme Uji Secara Kualitatif dan Kuantitatif
BIOTEKNOLOGI

A. Metode Pengujian Secara Kualitatif dengan kertas cakram

I. Tahapan Persiapan Bakteri uji dan Sampel Uji :
1. Inokulasi satu ose bakteri uji dalam 5 ml medium Nurien Broth (NB) dan inkubasi
bergoyang selama 24 jam pada suhu ruang dan encerkan hingga konsenterasi 10 5
cfu/ml.
2. Encerkan 50.000 kali sampel uji dengan pure water sehingga konsentrasinya
menjadi 0,001%.
II. Tahapan Pengujian Contoh Uji
1. Buat medium untuk lapisan bawah (bottom layer) dengan menuang 10-15 ml
medium Nutrien Agar (NA) dengan konsentrasi penuh atau 1 resep (0,8% NA)
dan diamkan hingga padat.
2. Buat lapisan pembenihan dengan menginokulasikan bakteri uji dalam resep NA
(0,2 % untuk E. coli dan 0,1% untuk S. aureus). Tuang 8 ml lapisan pembenihan
tersebut diatas cawan yang berisi NA. Biarkan pada suhu ruang sampai membeku.
3. Teteskan larutan uji pada kertas cakram sebanyak 30 l (diameter cakram 0,6
mm) dan biarkan sampai menyerap seluruhnya. Teteskan juga larutan pengencer
sebagai kontrol negatif dan sampel yang tidak diencerkan sebagai kontrol positif.
4. Tempelkan kertas cakram pada medium yang sudah ditambahkan mikroba uji.
Tempatkan cawan petri pada bidang datar pada suhu refrigerator (4-8C) selama 1-
2 jam.
5. Kemudian masukkan ke dalam inkubator pada temperatur yang sesuai untuk
bakteri uji.
III. Prosedur pengamatan dan pelaporan
1. Amati diameter daerah hambatan yang terbentuk dan lakukan pengukuran dengan
menggunakan alat ukur yang sesuai yaitu jangka sorong.
2. Diameter daerah hambatan yang terbentuk dapat dinyatakan sebagai hasil positif
(+) secara kualitatif.
3. Diameter derah hambatan yang tidak terbentuk dinyatakan sebagai hasil negatif
(-) secara kualitatif.
4. Amati Kontrol negatif yang digunakan, kontrol ini tidak menghasilkan zona
hambatan disekitar cakram.
5. Amati Kontrol positif yang digunakan, kontrol ini menghasilkan zona hambatan
disekitar cakram.

Kode Dok: Terbitan ke: 1 Disetujui oleh: MT

Revisi ke: 0 Tanggal Terbit: 13.04.2015 Hal ke 2 dari 3
 INSTRUKSI KERJA
Laboratorium Pengujian
Uji Daya Hambat Bahan Aktif terhadap Mikroorganisme Uji Secara Kualitatif dan Kuantitatif
BIOTEKNOLOGI

B. Metode Pengujian Secara Kuantitatif

I. Tahapan Persiapan Bakteri uji dan Sampel Uji :
1. Inokulasi satu ose bakteri uji dalam 5 ml medium Nurien Broth (NB) dan inkubasi
bergoyang selama 24 jam pada suhu ruang dan encerkan hingga konsenterasi 10 5
cfu/ml.
2. Encerkan 50.000 kali sampel uji dengan pure water sehingga konsentrasinya
menjadi 0,001%.
II. Tahapan Pengujian Contoh Uji
1. Inokulasi kultur bakteri uji (2 % untuk E. coli dan 0,1% untuk S. aureus) dan 30
l larutan antiseptik kedalam 5 ml NB cair, dan inkubasi pada temperatur
pertumbuhan bakteri uji selama 24 jam.
2. Lakukan pengamatan dengan mengukur kekeruhan sel (spektrofotometer pada =
660 nm) dan lakukan uji TPC (Total Plate Count) dengan cara cawan tuang
(spread plate). Pengamatan dan uji TPC dilakukan pada 0, 5, 12, dan 24 jam.
3. Catat setiap hasil dari pengukuran kekeruhan sel dan TPC pada Log Book Analis
dan buat kurva penurunan pertumbuhan bakteri uji.
4. Laporkan hasil dengan menggunakan FR/PR/5.4/1/2: Fom Data Hasil Analisis
Sampel dari Analisis.
5. Lakukan pemusnahan seluruh mikroorganisme uji yang terdapat pada standar dan
contoh uji dengan menggunakan IK/PM 5.5/6: Instruksi Kerja Otoklaf

6. Dokumen terkait;
PR/5.4/1 : Pengujian
IK/PM 5.5/2 : Instruksi Kerja Timbangan Analitik
IK/PM 5.5/6 : Instruksi Kerja Otoklaf
IK/PM 5.5/7 : Instruksi Kerja Inkubator

FR/PR/5.4/1/2 : Fom Data Hasil Analisis Sampel dari Analisis

Buku : Log Book Analis

Kode Dok: Terbitan ke: 1 Disetujui oleh: MT

Revisi ke: 0 Tanggal Terbit: 13.04.2015 Hal ke 3 dari 3