VALIDASI METODE PARAMETER LOD DAN LOQ

PADA TABLETPARASETAMOL MENGGUNAKAN

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS


I. Tujuan
Praktikan dapat mengetahui dan melakukan validasi metode parameter batas deteksi (LOD)
dan batas kuantifikasi (LOQ) terhadap tablet parasetamol menggunakan spektrofotometri UV-
Vis.

II. Prinsip
1. Akurasi
2. Presisisi
3. Linieritas
4. Spesifisitas
5. LOD dan LOQ

III. Teori Dasar
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian
terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi metode analisis
bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai
untuk peruntukannya (Gandjar, 2007).
Klasifikasi Metode Analisis
Menurut USP 30-NF25 (2007), metode analisis diklasifikasikan dalam 3 kategori,
yaitu:
a. Kategori I :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kadar komponen utama
dalam bahan baku obat dan sediaan obat jadi atau bahan aktif lainnya seperti
pengawet
b. Kategori II :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan cemaran dalam bahan
baku obat atau hasil degradasinya dalam sediaan obat jadi
c. Kategori III :
Metode analisis yang digunakan untuk penetapan kinerja dan kualitas
sediaan obat jadi, seperti uji disolusi dan uji pelepasan obat (Gandjar, 2007).
Parameter Validasi Metode Analisis
Prosedur analisis yang harus divalidasi meliputi beberapa jenis pengujian,
yaitu adanya pengotor, uji limit untuk mengendalikan keberadaan pengotor, serta uji
kuantitatif komponen aktif atau komponen lain dalam produk obat-obatan. Selain
itu, terdapat 8 parameter validasi metode
analisis yaitu spesifisitas, presisi/ketelitian, akurasi/ketepatan, linearitas, kisaran, limit
deteksi, limit kuantitasi, dan ketangguhan. Pemilihan parameter yang akan diuji
tergantung dari jenis dan metode pengujian yang akan divalidasi (Chan, 2004).
a. Akurasi
Ads by Webexp%20EnhancedAd Options
Accuracy adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar
analit yang sebenarnya. Accuracy dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit
yang ditambahkan. Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di
dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi
hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan
peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan
suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur (Gandjar, 2007).
Accuracy dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-placebo
recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (Riyadi,
2009). Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam
keseluruhan tahapan analisis. Dalam metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan
ke dalam plasebo, lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar
standar yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara
membuat sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan
konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian
dianalisis dengan metode yang akan divalidasi (Riyadi, 2009).
Dalam metode adisi (penambahan baku), sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit
yang diperiksa (pure analit/standar) ditambahkan ke dalam sampel, dicampur dan dianalisis lagi.
Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya. Pada metode penambahan
baku, pengukuran blanko tidak diperlukan lagi. Metode ini tidak dapat digunakan jika
penambahan analit dapat mengganggu pengukuran, misalnya analit yang ditambahkan
menyebabkan kekurangan pereaksi, mengubah pH atau kapasitas dapar, dll. Recovery
dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. Biasanya
persyaratan untuk recovery adalah tidak boleh lebih dari 5% (Riyadi, 2009).

b. Presisi
Ads by Webexp%20EnhancedAd Options
Precision adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur
diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang
homogen. Presicion diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif
(koefisien variasi). Precision dapat dinyatakan sebagai repeatability (keterulangan) atau
reproducibility (ketertiruan). Repeatability adalah keseksamaan metode jika dilakukan
berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang
pendek. Repeatability dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap
sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran
keseksamaan pada kondisi yang normal (Riyadi, 2009).
Reproducibility adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang
berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda
menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Analisis
dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang
sama. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif (RSD)
atau koefisien variasi (CV) 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel
tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi
laboratorium (Riyadi, 2009).

c. Linieritas dan Rentang
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi
tertentu. Sedangkan rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang
sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat
diterima. Rentang dapat dilakukan dengan cara membuat kurva kalibrasi dari beberapa set
larutan standar yang telah diketahui konsentrasinya (Ermer & Miller 2005).
Ads by Webexp%20EnhancedAd Options
Persamaan garis yang digunakan pada kurva kalibrasi diperoleh dari metode kuadrat
terkecil, yaitu y = a + bx. Persamaan ini akan menghasilkan koefisien korelasi (r). Koefisien
korelasi inilah yang digunakan untuk mengetahui linearitas suatu metode analisis. Penetapan
linearitas minimum menggunakan lima konsentrasi yang berbeda. Nilai koefisien korelasi yang
memenuhi persyaratan adalah lebih besar dari 0.9970 (ICH, 1995). Linearitas juga dapat
diketahui dari kemiringan garis, intersep, dan residual (Ermer & Miller 2005).
d. Selektivitas (Spesifisitas)
Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang
hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya
komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali
dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang
dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa
cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan
terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang
ditambahkan. Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji
keduanya. Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat
diperoleh, maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis
sampel yang mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang
hendak diuji lalu dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian
seperti kromatografi, hhanalisis kelarutan fase, dan Differential Scanning
Calorimetry. Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan
ukuran selektivitas (Riyadi, 2009).
e. Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi
Limit deteksi merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil analit dalam sampel yang dapat
dideteksi, namun tidak perlu diukur sesuai dengan nilai sebenarnya. Limit kuantitasi adalah
jumlah analit terkecil dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif pada tingkat
ketelitian dan ketepatan yang baik. Limit kuantitasi merupakan parameter pengujian kuantitatif
untuk konsentrasi analit yang rendah dalam matriks yang kompleks dan digunakan untuk
menentukan adanya pengotor atau degradasi produk. Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung
dari rerata kemiringan garis dan simpangan baku intersep kurva standar yang
diperoleh (ICH, 1995).

Asetaminofen

Ads by Webexp%20EnhancedAd Options



Parasetamol atau asetaminofen adalah turunan para-aminophenol memiliki
khasiat sebagai analgesik, antipiretik, dan aktivitas antiradang yang lemah. Parasetamol
merupakan analgesik non-opioid sering dicoba pertama untuk pengobatan gejala berbagai
tipe sakit kepala termasuk migrain dan sakit kepala tipe tensi.
Pemerian : serbuk hablur, putih; tidak berbau; rasa sedikit pahit.
Berat jenis : 1.263 g/cm
3

Titik lebur : 169C (336F)
Kelarutan : dalam air 1,4 g/100 mL atau 14 mg/mL (20C); larut
dalam air medidih, dan dalam NaOH 1 N; mudah larut
dalam etanol, methanol, tidak larut dalam kloroform,
praktis tidak larut dalam eter, pentana dan benzene
Nama Kimia : N-acetyl-p-aminophenol atau p-asetamedofenol atau
4- hidroksiasetanilida
Rumus Empiris: C
8
H
9
NO
2

Berat Molekul : 151,16
Jarak lebur : antara 168-172 (Depkes RI, 1995).
Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada
panjang gelombang 245 nm (A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang
gelombang 257 nm (A11=715a) sedangkan pada inframerah memperlihatkan
puncak pada 1506, 1657, 1565, 1263, 1227, 1612 cm1. (Moffat dkk, 2005).
Spektrofotometri UV-Visible
Ads by Webexp%20EnhancedAd Options
Spektrofotometer UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan
intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang di absorbsi oleh sampel.
Spektrofotometer UV-Vis biasanya digunakan untuk molekul dan ion
anorganik atau kompleks dalam larutan. Sinar ultraviolet berada pada panjang
gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar tampak berada pada panjang
gelombang 400-800 nm. Sebagai sumber cahaya biasanya di gunakan lampu
hydrogen atau deuterium untuk pengukuran UV dan lampu tungsten untuk
pengukuran pada cahaya tampak (Dachriyanus, 2004).

IV. Alat dan Bahan
Alat dan gambar alat
No Alat Gambar Alat
1 Beaker glass


2 Bulb pipet


3 Labu Ukur

4 Mortir dan stamper

5 Neraca Analitik

6 Spektrofotometer UV


7 Volume pipet




Bahan
1. Etanol 95%
2. Tablet parasetamol

V. Prosedur
Pembuatan kurva baku
Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama, kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add hingga tanda batas.
Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat pengenceran hingga
diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan 12 ppm. Masing-
masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV pada panjang
gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Preparasi sampel dan pembuatan larutan stock parasetamol
Tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus menggunakan mortir dan stamper hingga
halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang sebanyak 50 mg secara seksama, lalu
dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu ditambahkan 20 ml etanol, dikocok
hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan
tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtratnya
diambil.

Pengenceran sampel parasetamol
1. Larutan 100 ppm
Dipipet 2 ml larutan parasetamol 1000 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20
ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 100 ppm.
Larutan tersebut dikocok hingga homogen.
2. Uji LOD ,8415 ppm
Dipipet 0,17 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20
ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 0,8415 ppm.
Larutan tersebut dikocok hingga homogen.
3. Uji LOQ 2,8052 ppm
Dipipet 0,56 ml larutan parasetamol 100 ppm dan dimasukkan ke dalam labu ukur 20
ml. Kemudian di-add etanol hingga tanda batas dan diperoleh konsetrasi 2,8052 ppm.
Larutan tersebut dikocok hingga homogen.

VI. Data Pengamatan dan Perhitungan
DATA PENGAMATAN AKURASI TABLET PARACETAMOL
Pembuatan larutan tablet parasetamol
Massa tablet rata- rata = 545,24 mg
Dibuat konsentrasi larutan stok sampel
= 500 mg/ 50 ml
= 10000 ppm
Diencerkan = 400 ppm
Dibuat 3 variasi konsentrasi :
1. 12 ppm
V x 400 ppm = 20 x 12 ppm
V = 0.6 ml
2. 10 ppm
V x 400 ppm = 20 x 10 ppm
V = 0.5 ml
3. 8 ppm
V x 400 ppm = 20 x 8 ppm
V = 0.4 ml
Nilai absorbansi
Konsentrasi
Absorbansi
I II III
Rata- rata
8 ppm 0.5256 0.5256 0.5254
0.5255
10 ppm 0.6888 0.6885 0.6888
0.6887
12 ppm 0.8231 0.8230 0.8241
0.8234
Persamaan garis larutan baku : y = 0.07012x 0.091472

Perhitungan konsentrasi sampel
1. 8 ppm
0.5255 = 0.07012x 0.091472
x = 8,800 ppm
2. 10 ppm
0.6887 = 0.07012x 0.091472
x = 11,126 ppm
3. 12 ppm
0.8234 = 0.07012x 0.091472
x = 13,047 ppm

Persen recovery
Persen recovery (%) = x 100 %
Keterangan :
a = konsentrasi contoh + konsentrasi standar yang ditambahkan
b = konsentrasi contoh
c = konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan

1. 8 ppm
= x 100 % = 110 %
2. 10 ppm
= x 100 % = 111,26 %
3. 12 ppm
= x 100 % = 108,725 %
Dari hasil yang diperoleh, nilai ini masih dapat diterima akurasinya karena menurut
(AOAC, 1998), secara umum nilai akurasi yang dapat diterima sebesar 80- 120%.

DATA PENGAMATAN PRESISI TABLET PARACETAMOL
Penimbangan Tablet dan Sampel
Berat 20 tablet = 12,6672 gram
Berat 1 tablet = 0,63336 gram
Jumlah parasetamol dalam tablet 0,63336 gram adalah 0,5000 gram atau 500 mg
Berat Sampel obat yang ditimbang = 0,0632 gram
Berat parasetamol dalam sampel adalah = 0,4989 gram

Perhitungan konsentrasi sampel
Kadar Sampel = = 1995,6 ppm

Pengenceran Sampel
V1 x N1 = V2 X N2
V1 x 1995,6 = 25 ml x 6 ppm
V1 = 0,075 ml ........... Ad hingga 25 ml

Hasil Absorbansi

Pengulangan Absorbansi Kadar ( x ) ( x - ) ( x - )
2

1 0,3315 108,5 7,49 56,1001
2 0,3072 100,56 -0,45 0,2025
3 0,3040 99,51 -1,5 2,25
4 0,3024 98,98 -2,03 4,1209
5 0,3028 99,12 -1,89 3,5721
6 0,3036 99,37 -1,64 2,6896

Perhitungan Standar Deviasi
SD = = = 3,713

Perhitungan RSD

RSD = = 0,0367
Perhitungan CV

CV = 0,0367 X 100 % = 3,67 %
Perhitungan CV Harwitz

CV (%) = 0,66 X 2
1 ( 0,5 X 6 )
= 0,165 %

DATA PENGAMATAN LINEARITAS TABLET PARASETAMOL
Larutan baku paracetamol 100 ppm
Blanko H2O : NaOH (1:1)
Pengenceran (Volume 10 ml)
Volume standar (ml) Konsentrasi (ppm)
0,4 4
0,6 6
0,8 8
1,0 10
1,2 12

Pengukuran Absorbansi
Konsentrasi (ppm) A1 A2 A3 A4 A5 A6
4 0,2092 0,2097 0,2120 0,2106 0,2102 0,2097
6 0,3050 0,3048 0,3052 0,3061 0,3062 0,3055
8 0,4622 0,4618 0,4610 0,4621 0,4621 0,4620
10 0,6176 0,6176 0,6174 0,6170 0,6181 0,6147
12 0,7561 0,7549 0,7562 0,7550 0,7558 0,7545

Linearitas
Pengukuran R a b
1 0,9971 0,07032 -0,09654
2 0,99703 0,07016 -0,091152
3 0,99677 0,07003 -0,08988
4 0,99712 0,069985 -0,08972
5 0,997132 0,070155 -0,09076
6 0,99714 0,070075 -0,09078
Rata-Rata 0,99704 0,07012 -0,091472


DATA PENGAMATAN SPESIFISITAS TABLET PARASETAMOL
a. Berat tablet total (19 tablet) = 13095,1 mg
b. Berat satuan tablet (1/19 tablet) = 677,6 mg
c. Berat serbuk total (19 tablet) = 12900 mg
d. Berat serbuk (1/19 tablet) = 682 mg
e. Konsentrasi filtrate tablet Parasetamol (larutan filtrate stock)
Konsentrasi = 5000 ppm
f. Pengenceran filtran tablet parasetamol
- 400 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

5000 ppm x V
1
= 400 ppm x 25 mL
V
1
= 2 mL
- 40 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

400 ppm x V
1
= 40 ppm x 10 mL
V
1
= 1 mL
g. Pembuatan larutan Saccharum Lactis
Konsentrasi = 5000 ppm
h. Pembuatan larutan uji tablet parasetamol
No. Larutan Filtrat Larutan SL Pelarut Total
1. 2,5 mL 0 22,5 mL 25 mL
2. 2,5 mL 1 mL 21,5 mL 25 mL
3. 2,5 mL 2 mL 20,5 mL 25 mL
4. 2,5 mL 3 mL 19,5 mL 25 mL
5. 2,5 mL 4 mL 18,5 mL 25 L

i. Perhitungan parasetamol teoritis
- 4 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

400 ppm x V
1
= 4 ppm x 25 mL
V
1
= 2,5 mL
j. Perhitungan saccharum lactis teoritis
- 200 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

5000 ppm x V
1
= 200 ppm x 25 mL
V
1
= 1 mL
- 400 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

5000 ppm x V
1
= 400 ppm x 25 mL
V
1
= 2 mL
- 600 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

5000 ppm x V
1
= 600 ppm x 25 mL
V
1
= 3 mL
- 800 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

5000 ppm x V
1
= 800 ppm x 25 mL
V
1
= 4 mL
k. Pembuatan Kurva Baku Parasetamol
Konsentrasi = 100 ppm
Pengenceran :
- 4 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

100 ppm x V
1
= 4 ppm x 10 mL
V
1
= 0,4 mL
- 6 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

100 ppm x V
1
= 6 ppm x 10 mL
V
1
= 0,6 mL
- 8 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

100 ppm x V
1
= 8 ppm x 10 mL
V
1
= 0,8 mL
- 10 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

100 ppm x V
1
= 10 ppm x 10 mL
V
1
= 1 mL
- 12 ppm
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

100 ppm x V
1
= 12 ppm x 10 mL
V
1
= 1,2 mL

l. Absorbansi Baku Parasetamol

Konsentrasi
(ppm)
Absorbansi
A1 A2 A3 A4 A5 A6
4 0,2092 0,2097 0,2120 0,2106 0,2102 0,2097
6 0,4622 0,4618 0,4610 0,4621 0,4621 0,4620
8 0,3050 0,3048 0,3052 0,3061 0,3062 0,3055
10 0,6176 0,6176 0,6174 0,6170 0,6181 0,6174
12 0,7561 0,7549 0,7562 0,7550 0,7558 0,7545

Persamaan Garis
- y = 0,07032 x 0,09254
r
2
= 0,9971
- y = 0,07016 x 0,091152
r
2
= 0,99703
- y = 0,07003 x 0,08988
r
2
= 0,99677
- y = 0,069985 x 0,08972
r
2
= 0,99712
- y = 0,070155 x 0,09076
r
2
= 0,997132
- y = 0,070075 x 0,09078
r
2
= 0,99714

rata-rata persamaan garisnya :
y = 0,070120833 x 0,0908053

m. Absorbansi Larutan Uji
No. A1 A2 A3 Rata-rata A
1 0,3063 0,3060 0,3059 0,3060
2 0,3166 0,3167 0,3163 0,3165
3 0,3132 0,3133 0,3136 0,3134
4 0,3727 0,3726 0,3729 0,3727
5 0,3299 0,3294 0,3292 0,3295

n. Perhitungan Konsentrasi Parasetamol nyata
y = 0,070120833 x 0,0908053
x =
1. x = = 5,66 ppm
2. x = = 5,81 ppm
3. x = = 5,76 ppm
4. x = = 6,61 ppm
5. x = = 5,99 ppm

o. Perhitungan % Recovery
% recovery = x 100 %
1. % recovery = x 100 % = 0,332 %
2. % recovery = x 100 % = 0,362 %
3. % recovery = x 100 % = 0,352 %
4. % recovery = x 100 % = 0,522 %
5. % recovery = x 100 % = 0,398 %

Rata-rata % Recovery = 0,3932 %

DATA PENGAMATAN LOD DAN LOQ TABLET PARASETAMOL

Tabel Hasil Pengukuran Absorbansi
No Konsentrasi Absorbansi
1 4 ppm 0.21023
2 6 ppm 0.30547
3 8 ppm 0.46187
4 10 ppm 0.61752
5 12 ppm 0.75542
Rata-rata 0.4701

Perhitungan pengenceran larutan baku
Larutan Baku Stock 100 ppm
1.
2.
3.
4.
5.


No Konsentrasi (x) Absorbansi (y) y
i
(y-y
i
)
1 4 ppm 0.21023 0.18961 0.000425
2 6 ppm 0.30547 0.32985 0.000594
3 8 ppm 0.46187 0.47009 0.0000674
4 10 ppm 0.61752 0.61033 0.0000517
5 12 ppm 0.75542 0.75057 0.0000235
Jumlah 0.00116

y
i
didapat dari persamaan regresi y = 0.07012 x 0.09087
x
1
= 4 ppm y = 0.07012 x 4 0.09087 = 0.18961
x
2
= 6 ppm y = 0.07012 x 6 0.09087 = 0.32985
x
3
= 8 ppm y = 0.07012 x 8 0.09087 = 0.47009
x
4
= 10 ppm y = 0.07012 x 10 0.09087= 0.61033
x
5
= 12 ppm y = 0.07012 x 12 0.09087= 0.75057


Tabel Hasil Pengukuran LOD dan LOQ
Konsentrasi Absorbansi Rata-rata
LOD 0.8415 ppm 0.0722 0.0722 0.0721 0.07217
LOQ 2.8052 ppm 0.0724 0.0723 0.0721 0.07227

Larutan stock sampel 1000 ppm
Pengenceran stock
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

1000 x V
1
= 100 x 20
V
1
= 2 mL

Pengenceran larutan uji LOD
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

100 x V
1
= 0.8415 x 20
V
1
= 0.1683 mL

Pengenceran larutan uji LOQ
M
1
x V
1
= M
2
x V
2

100 x V
1
= 2.8052 x 20
V
1
= 0.56104 mL



VII. Pembahasan Validasi LOD dan LOQ

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer
ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu seyawa obat,
serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva validasi, akurasi,
presisi, LOD, LOQ) dan penetapan kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan adalah tablet
paracetamol dan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu praktikum selama 2 kali
pertemuan.
Spektrofotometer ultraviolet visible merupakan alat dengan teknik spektrofotometer pada
daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk mengukur serapan sinar ultra
violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri
UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya
diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan
cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari
molekul. Spektra UV-Vis dari senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi
diantara tingkatan-tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi
oleh molekul organik aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonjugasi dan atau
atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari
tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding
dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan antara serapan
cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan.
Spektrofotometer UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada
analisa kualitatif karakteristik resapan suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu panjang gelombang
maksimum dan daya resapnya. Penentuan panjang gelombang maksimum dengan membuat
spektrum dengan cara membuat larutan baku primer/induk.
Langkah awal yang dilakukan adalah tablet parasetamol sebanyak 20 tablet digerus
menggunakan mortir dan stamper hingga halus. Kemudian serbuk parasetamol ditimbang
sebanyak 50 mg secara seksama, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Ke dalam labu
ditambahkan 20 ml etanol, dikocok hingga larut lalu di-add etanol hingga tanda batas dan
diperoleh konsentrasi 1000 ppm. Larutan tersebut dikocok hingga homogen, kemudian disaring
menggunakan kertas saring dan filtratnya diambil. Setelah tahap preparasi sampel, dilakukan
tahap pembuatan kurva baku. Parasetamol BPFI ditimbang sebanyak 5 mg secara seksama,
kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Kemudian dilarutkan dengan etanol dan di-add
hingga tanda batas. Diperoleh larutan baku stock 100 ppm. Dari larutan baku tersebut dibuat
pengenceran hingga diperoleh 5 konsentrasi yang berbeda yaitu 4ppm, 6ppm, 8ppm, 10ppm, dan
12 ppm. Masing-masing konsetrasi diukur absorbansinya menggunakan sperktrofotometer UV
pada panjang gelombang 245 nm kemudian dibuat kurva baku.

Pipet sejumlah volume larutan induk dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh
konsentrasi 10 um/mL . setelah itu ukur serapannya dengan spektrofotometer untuk menentukan
panjang gelombang maksimum. Setelah dianalisis dengan spektrofotometer didapatkan panjang
gelombang maksimum untuk paracetamol adalah 243 nm. Berdasarkan literature, panjang
gelombang paracetamol 245 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih sesuai dengan
panjang gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak terlalu jauh berbeda. Setelah
itu, membuat kurva kalibrasi berdasarkan data panjang gelombang maksimum yang diperoleh,
dibuat lima seri konsentrasi larutan dari larutan induk dengan menggunakan rumus Lambert
Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi larutan sebelumnya, ditentukan nilai konsentrasi
minimum dan maksimum dengan rumus A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang didapat
adalah 4 ppm dan nilai konsentrasi maksimumnya 12 ppm. Selanjutnya dibuat lima seri
konsentrasi larutan yaitu 4,6,8,10,12, ppm. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan pada
panjang gelombang maksimum baku. Sehingga didapatkan persamaan regresi linear yaitu
y=0,0702x - 0,09087. sehingga diperoleh nilai resapan 0,997 .

Selanjutnya dihitung parameter validasi. Parameter validasi berguna untuk membuktikan
bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi
parameter adalah untuk menjamin metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil
yang cermat dan handal serta dapat dipercaya. Parameter yang diuji dalam validasi meliputi
akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit deteksi, limit kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan,
kekuatan, stabilitas, dan uji kesesuaian sistem.

Setelah itu dicari batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ). Batas deteksi adalah
titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari ketidakpastian yang terkait dengannya. Ini
adalah konsentrasi terendah dari analit dalam suatu sampel yang dapat dideteksi namun tidak
selalu diukur. Batas deteksi sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari
metode analisis adalah kemampuan metode ini untuk membedakan perbedaan-perbedaan kecil
konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah praktis, sensitivitas kemiringan kurva kalibrasi
yang diperoleh dengan merencanakan respons terhadap konsentrasi analit atau massa.
Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah injeksi yang menghasilkan puncak
dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali lebih tinggi tingkat kebisingan
baseline. Selain itu sinyal / kebisingan metode, yang ICH menjelaskan tiga metode lebih
lanjut:
1. Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh analisis sampel dengan
konsentrasi analit dan dikenal dengan penentuan tingkat minimum yang analit dapat
dipercaya terdeteksi.
2. Standar deviasi respon berdasarkan deviasi standar dari kosong:
Pengukuran besarnya respons latar belakang analitis dilakukan dengan menganalisis
jumlah sampel yang tepat kosong dan menghitung standar deviasi tanggapan ini.
3. Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan kurva kalibrasi: Sebuah
kurva kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan sampel yang mengandung analit
dalam kisaran batas deteksi. Deviasi standar residu dari garis regresi, atau standar deviasi
dari y-perpotongan garis-garis regresi, dapat digunakan sebagai standar deviasi.


Gambar 1. Batas deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan
Batas kuantifikasi (LOQ) adalah jumlah minimum yang disuntikkan
menghasilkan pengukuran kuantitatif dalam matriks target dengan presisi diterima dalam
kromatografi, biasanya membutuhkan ketinggian puncak 1-20 kali lebih tinggi dari dasar
suara.
Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi telah ditentukan, EURACHEM
(Gambar 2) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah sampel dengan penurunan jumlah
analit adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari ketepatan diplot terhadap
jumlah analit. Jumlah yang sesuai dengan yang dibutuhkan presisi didefinisikan
sebelumnya adalah sama dengan batas kuantisasi.Adalah penting untuk tidak hanya
menggunakan standar murni untuk tes ini tetapi juga matriks runcing yang erat
merupakan sampel yang tidak diketahui.
Untuk batas deteksi, para ICH merekomendasikan, di samping prosedur seperti
yang dijelaskan di atas, inspeksi visual dan deviasi standar respon dan kemiringan kurva
kalibrasi.


Gambar 2. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode.

Berdasarkan hasil perhitungan tersebut, didapat yaitu nilai LOD 0.8415 dan nilai LOQ
yaitu 2.8052. LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan dengan presisi dan
akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.



VIII. Kesimpulan

LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi
meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan nilai LOQ merupakan konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang masih dapat ditentukan. Nilai LOD yaitu 0.8415 dan nilai LOQ
yaitu 2.8052.




DAFTAR PUSTAKA

Association of Official Analytical Chemists. 1998. AOAC Perr- Verified Methods Program. Arlington :
AOAC International.
Chan, C. C,. Lam, Herman. Lee, Y. C. and Zhang, Xue-Ming. 2004. Analytical Method Validation and
Instrument Performance Verification. John Wiley & Sons. Canada.
Dachriyanus. 2004. Analisis Struktur Senyawa Organik Secara Spektroskopi Edisi I. Penerbit Andalas
University Press. Padang.
Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI. Jakarta.
Ermer, J.H. and Miller, McB. 2005. Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best
Practice. Wiley-Vch. Verlag GmbH & Co. KGaA. Weinheim.
Gandjar, G.I & Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Belajar. Yogyakarta.
[ICH] International Conference on Harmonization. 2005. Validation of Analytical Procedures: Text and
Methodology Q2(R1). Tersedia di http://www.ich.org. [diakses tanggal 06 Juni 2013].
Moffat, A.C., dkk. 2005. Clarkes Analysis Of Drug And Poisons. Thirth edition. Pharmaceutical Press.
Electronic version. London.
Riyadi, Wahyu. 2009. Validasi Metode Analisis. Tersedia di http://www.chem-is-
try.org/artikel_kimia/kimia_analisis/validasi-metode-analisis/ [diakses tanggal 06 Juni 2013].


Read more: http://laporanakhirpraktikum.blogspot.com/2013/07/aa.html#ixzz2oSG4RUDI