High Performance Liquid

Chromatography

Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt.

Bagaimana cara Memilih
Detektor
???
 Detektor

Bagaimana
Memilih detektor
dan
Apa pertimbangannya

???

HPLC-2012 3
 Detektor
 Bulk property detector :
- mengukur sifat solute dan fase gerak
contoh : detektor indeks bias ( RI )

 Solute property detector :

- hanya mengukur sifat solute
- 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD
Contoh : detektor UV

HPLC-2012 (Settle, 1997; Kellner dkk., 1998; Adamovics, 1997) 4

 Untuk Analisis Kuantitatif

Senyawa yang
memiliki nilai koefisien ekstingsi molar [  ]

 ≥ 1000 M -1. cm -1

mudah dianalisis
secara spektrofotommetri

HPLC-2012 5
Rumus Pendekatan

A=bc

=A 1%
1cm x
BM
10
M-1. cm-1
 Detektor

Detektor lain untuk HPLC :

Fluorescen
Elektrokimia
Konduktivitas
Mass spectrometer

(Settle, 1997; Kellner dkk., 1998; Adamovics, 1997)

HPLC-2012 7
HPLC-2012 8
HPLC-2012 9
 HPLC-UV Detection
 Untuk keperluan analisis komponen utama dalam sampel
secara HPLC-UV diperlukan minimal nilai  senyawa
harus ≥ 10 M-1. cm-1 pada  ≥ 185 nm.
 Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-UV
diperlukan minimal nilai  senyawa harus ≥ 1000 M-1.
cm-1
 Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV, senyawa
dengan nilai  senyawa  100 M-1. cm-1 tidak mungkin
dilakukan

HPLC-2012 Snyder dkk., 1997, p.63 10

 Kromofor UV-HPLC

HPLC-2012 11
 Kromofor UV-HPLC


HPLC-2012 12
 220
nm

254
nm

HPLC-2012 13
HPLC-2012 14
 Contoh Pengaturan Sensitivitas
( AUFs )
pada kromatogram hplc

HPLC-2012 15
HPLC-2012 16
 Mengapa HPLC-UV
Lebih Sensitif Dibanding
Spektrofotometri UV

HPLC-2012 17
 HPLC
Acetaminophen, Phenylephrine, and
Carbinoxamine.

HPLC-2012 18
 . ?
..
n
l
i ]o
s
Ep [ 

HPLC-2012 19
 0.1 Au

0.4 Au

HPLC-2012 20
 0.2 Au 0.1 Au

0.4 Au 0.4 Au

A B

HPLC-2012 21
 Luminescence

Bagaimana terjadinya fluorescensi ???

Fluorescensi

HPLC-2012 22
 Detektor UV vs Fluorescen

UV

Fluorescen

HPLC-2012 23
Bagaimana cara Melakukan
derivatisasi
???
 Derivatisasi

Apa arti derivatisasi … ?

Apa tujuannya … ?
Bagaimana caranya … ?
Derivatisasi Post-/Pre-column … ?

HPLC-2012 25
 Tujuan Derivatisasi
 Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan
pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat
(turunan) senyawa ybs

 Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi

menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor 
senyawa berkromofor)

 Meningkatkan daya deteksinya (senyawa berkromofor

UV  senyawa berkromofor fluorescensi)

HPLC-2012 26
 Captopril
HS CH 3
O

N COOH

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC

dengan detektor UV ?
HPLC-2012 27
 Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide

HS CH 3
O
O
N COOH + Br C-CH 2 -Br

E
t
i
Captopril l p -Br fenacylbromide
a
m
i
n
HPLC-2012 28
 Hasil derivatisasi :
Captopril + p -Br Fenacylbromide

HS CH 3
O
O O
N C-O-CH 2 -C Br

Dapat dideteksi secara UV

HPLC-2012 29
 PK. Captopril (HPLC)
 Parameter HPLC : (J.Pharm.Biomed.Anal., 1995, 13: 655-660)
- Column : 250 x 4.6 mm, Kontron Analytical S5
ODS2
- Mobile phase : MeCN: 1% Acetic acid (60:4)
- Flow rate : 1.3 mL/min.
- Detector : UV 260 nm
- Retention time : 4.0 min
- Limit of detection : 15 ng/mL
- Limit of quantitation: 30 ng/mL

HPLC-2012 30
 Gabapentin
O
H2 N C
OH

R-NH2

Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan

detektor UV atau Fluorescen ?
HPLC-2012 31
Derivatisasi dg Dansilklorid

H3 C CH3 H3 C CH3
N N

+ R-NH2

- HCl

O=S =O O=S =O

Cl NH

R
HPLC-2012
Dansil klorid Fluorescent derivative 32
 Contoh Senyawa
Asli
Yang
Berfluorescensi
 Kunang-kunang

HPLC-2012 34
 Fluorescensi

HPLC-2012 35
Asam Salisilat

O
C
OH

H
O
As.Salisilat - Fluorescensi

O
C
OH

H
O
 Papaverin HCl

H 3 CO

OCH 3
N
H 3 CO .HCl
CH2 OCH3
 Riboflavin
OH OH OH
CH 2 -CH-CH-CH-CH 2 OH

H3 C N N O

NH
H3 C N
O
 Bentuk Kromatogram

 Bentuk kromatogram (peak) ada berma- cam-

macam, a.l:
- tailing, fronting (leading)
- asimetri, simetri
- pecah
- lainnya

HPLC-2012 40
 Peak asymmetry - tailing

USP

HPLC-2012 41
 Peak
Asymmetry vs Tailing

Baca:
HPLC-2012
Snyder dkk., 1997 42
 Kriteria Peak

HPLC-2012 43
Bagaimana cara Mengatasi peak tailing
???
 Pengatasan Peak Tailing
Tambahkan 30 mM:
- Trietilamin (utk seny. basa)
- Amonium asetat (utk seny. asam)

 Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil-

amin dengan:
10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil-
amin asetat

 Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g

Bagaimana mekanisme kerja

TEA mencegah tailing ?
HPLC-2012 45
 Tailing Senyawa Basa
 Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam kolom
yang bersifat asam, akan berikatan kuat dengan senyawa
basa [ R-NH2 ] yang melewati kolom tersebut.

 Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin modifier ke

dalam campuran fase gerak, misal: trietilamin [ TEA ].

 TEA akan memasking residu Si-OH, sehingga saat

senyawa basa melewati kolom tidak terjadi ikatan yang
terlalu kuat, hingga akhirnya dapat memperkecil
terjadinya tailing.

HPLC-2012 46
 Penggunaan TEA
 Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak. Bila terlalu
banyak akan menghilangkan fungsi residu silanol pada
kolom RP-18.

 Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !

Perhatikan:
pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan

fase gerak yang mengandung TEA

HPLC-2012 47
Bagaimana cara Pencucian Kolom
???
 Pencucian Kolom
 Bersihkan kolom dengan solven yang kuat.
- Untuk kolom Reversed-phase:
gunakan campuran 96% diklorometan dan 4%
metanol dengan 0,1% amonium hidroksida

- Untuk kolom Normal-phase:

gunakan metanol
Pada keadaan yang sulit:
- lakukan “back-flushing” kolom dengan kece-
patan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]
HPLC-2012 49
 Solvent Index Eluotropic Values UV Cut
Polarity Alumina C18 Silica off
(nm)

Hexane 0,1 0,01 - 0,00 195

Cyclohexane 0,2 0,04 - - 200
Toluene 2,4 0,29 - 0,22 284
Tetrahydrofuram 4,0 0,45 3,7 0,53 212
Chloroform 4,1 0,40 - 0,26 245
Ethyl acetate 4,4 0,58 - 0,48 256
Acetone 5,1 0,56 8,8 0,53 330
Methanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205
Acetonitrile 5,8 0,65 3,1 0,52 190
Dimethylformamide 6,4 - 7,6 - 268
Dimethylsulfoxide 7,2 0,62 - - 268
- Snyder -dkk., 1997190
HPLC-2014 A 50
Water 10,2 -
 Pencucian Kolom
 Jika kolom selesai dioperasikan menggunakan fase gerak
yang mengandung:
- trietilamin
- tetrabutilamonium

Maka lakukan:
- pencucian kolom dengan campuran antara
metanol dan 0,05% asam fosfat (50 : 50), baru
kemudian dengan metanol

Jangan aliri kolom hanya dengan air !

HPLC-2012 51
 Column Cleaning

HPLC-2012 52
 Column Volume

HPLC-2012 53
 Column Cleaning

HPLC-2012 54
HPLC-2012 55
Kolom Terkontaminasi Metal
a

Baca:
Kromidas, S., 2000.

HPLC-2012 56
HPLC-2012 57
HPLC-2012 58
 Baca:
Kromidas, S., 2000.
HPLC-2012 59
HPLC-2012 60
HPLC-2012 61
HPLC-2012 62
HPLC-2012 63
 CTM

Cl O

H OH

.
CH 3 OH
N CH(CH 2 )2 N H
CH 3
O

HPLC-2012 64
 Pelarut untuk Sampel
Acetonitrile Mobile phase
Baca:
Snyder dkk., 1997, p.221
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

HPLC-2012 65
 Efek Temperatur

Baca:
Snyder dkk., 1997

HPLC-2012 66
Bagaimana cara Pengaturan pH Pada
Pemisahan
Senyawa Basa
???
HPLC-2012 68
69 HPLC-2012
 RP-Chromatography

HPLC-2012 70
HPLC-2012 71
HPLC-2012 72
 Morfin

HPLC-2012 73
 Chlorpheniramine Maleate

HPLC-2012 74
Lokas Anaestetik Basa

75 HPLC-2012
 HPLC Anaestetik Lokal

A B

Kolom: ODS Kolom: ODS

F.G : Acetonitril/Tris.HCl buffer F.G : Acetonitril/Tris.HCl buffer
pH 8.4 (60:40) 76 pH 7.4 (60:40)
HPLC-2012
 Amitriptilin

-H = Nortriptilin
77 HPLC-2012
78 HPLC-2012
 Contoh Lain
Ion Pairing Reagents

HPLC-2012 79
 ION PAIRING
[ pada hplc ]
 Adrenalin dapat dianalisis dengan kromato-grafi fase
normal (fase diam: silika gel, unmodified silica gel).

 Umumnya membutuhkan kondisi basa kuat, namun pada

kondisi tersebut gugus katekol pada adrenalin tidak
stabil [ masalah ]

 Sementara, pada hplc fase terbalik, adrenalin tidak

ditahan pada kolom dan terelusi pada void volume.

HPLC-2012 80
 Ion Pair Chromatography
 Metode yang umum digunakan untuk menga-nalisis
adrenalin dan senyawa-senyawa basa yang sangat mudah
larut air adalah dengan
Teknik:
“ kromatografi pasangan ion ”

 Hal tersebut secara mendasar dapat dipan-dang sebagai

pembentukan kolom penukar ion in situ.
 Proses tersebut diilustrasikan pada Gbr.12.14

HPLC-2012 81
 Adreanalin - Ion Pair
 Parameter HPLC:
Kolom : Oktadesil silan (ODS)
Fase gerak : Sodium phosphate buffer 0.1 M,
Methanol ( 9 : 1 ) mengandung
0.02% sodium octane sulfonic acid (SOSA).
[ SOSA terpartisi ke ODS dan menjenuhinya ]

 Selanjutnya, fase diam tersebut mampu mena-han

adrenalin dg interaksi elektrostatis.

Mengapa demikian ?
HPLC-2012 82
 Adrenalin - Ion Pair RP-HPLC

HPLC-2012 83
 Adreanlin-Ion Pair

 Mekanisme pemisahan:
Proses elusi terjadi melalui kombinasi antara:
penggantian adrenalin dari pasangan ionnya oleh ion Na+
dan dengan perpindahan pasangan ion itu sendiri dalam
fase gerak.

HPLC-2012 84
 Vitamin C
 Vitamin C merupakan senyawa yang sangat polar, dan
tidak ditahan dalam kolom fase terbalik.

 Salah satu teknik untuk menahannya pada kolom fase

terbalik adalah penggunaan rea-gen pasangan ion.

 Pada Gbr. 12.15, digunakan cetrimide sebagai reagen

pasangan ion dalam fase gerak.

HPLC-2012 85
 Vitamin C - Ion Pair
 Parameter HPLC adalah:
 Kolom : Oktadesil silan (ODS)
 Fase gerak : 0.1 M sodium acetate buffer pH
4.2 / acetonitrile 95 : 5 , mengandung 0.03
M cetrimide

 Dengan jumlah kecil pelarut organik dalam fase gerak,

memungkinkan kita memonitor dgn detektor
elektrokimia.

HPLC-2012 86
 Vitamin C

HPLC-2012 87
 Vitamin C - Ion Pair
 Selektivitas merupakan hal yang penting pada penentuan
Vitamin C karena:

vitamin C tersebut sering dijumpai dalam sediaan

multivitamin dan sebagai pengawet dalam sediaan
farmasi yang mengandung komponen-komponen lain
dalam jumlah besar.
[ berfungsi sebagai antioksidan ]

Watson, 2003: 265-266.

HPLC-2012 88
 Literatur

 Watson, D.G., 2003, Pharmaceutical Analysis, A Text-

book for Pharmacy Students and Pharma-
ceutical Chemists, Churchill Livingstone,
Edinburgh.

HPLC-2012 89
 Ion Pairing in HPLC
 Penggunaan pasangan ion menjadikan kromatografi fase
terbalik dapat untuk memisahkan solute yang terion,
yang umumnya tidak dapat ditahan oleh fase diam
hidrofobik.

 Counterion hidrofobik, seperti oktil sulfonat atau ion

tetrabutil amonium, ditambahkan ke larutan dan
membentuk pasangan ion Coulombic dengan solute yang
muatannya berlawanan.

HPLC-2012 90
 lanjutan…

 Hidrofobik counter ion umumnya adalah surface active

dan teradsorbsi pada fase diam.

Ohannesian, L. and Streeter, A.J., 2002, Handbook of

Pharmaceutical Analysis, Drug and The Pharma-
ceutical Sciences, volume 117, Marcel Dekker
Inc., New York.

HPLC-2012 91
 Acidic Mobile Phase
 Fase gerak pada kondisi asam dengan nilai pH 2,5 - 3
adalah kondisi yang baik untuk awal aplikasi pada
sediaan farmasi karena pH rendah tersebut dapat
menekan ionisasi kebanyakkn analit yang bersifat asam
dan menghasilkan waktu retensi yang panjang.

 Jenis asam yang biasa digunakan pada penyiapan fase

gerak adalah:
- asam fosfat, asam format, dan asam
asetat.

Mengapa demikian ?
HPLC-2012 92
 lanjutan…
 pH rendah juga dapat meminimalkan interaksi antara
senyawa basa (analit) dengan permukaan silanol pada
packing silika (karena silanol tidak terionisasi pH asam).
 pH rendah juga menjadikan umur kebanyakkan kolom
yang berbasis silika paling baik (lama) pada pH 2-8.
 Akan tetapi, senyawa basa (analit) akan mengalami
ionisasi pada pH rendah dan mungkin tidak akan
tertahan dalam kolom kecuali digunakan reagen
pasangan ion

HPLC-2012 93
 Ion-pairing Reagents
 Reagen-reagen pasangan ion adalah molekul-molekul
yang mirip deterjen yang ditambahkan ke fase gerak
untuk menyediakan retensi tambahan atau selektivitas
pada analit dengan muatan yang berlawanan.

 Alkil sulfonat rantai panjang umumnya digunakan untuk

pemisahan analit basa yang larut dalam air, seperti
terlihat pada Gbr.16 [ analisis vitamin-vitamin yang
larut air, WSV ] yang menggunakan Heksansulfonat.

HPLC-2012 94
 Multivitamin

Vit.C Vit.B2 Vit.B1

Niacin

Vit.B6 Niacinamid

Folic Acid

HPLC-2012 95
 Paling Tepat
Kita Pilih
Metode Kromatografi
 Pemisahan Vitamin-Vitamin Yang Larut Air
[ ion-pairing reagents ]

HPLC-2012 97
 Gambar: 1
HPLC-2012 98
 Ion Pair Reagent
Alkylamines Alkylsulfonates

HPLC-2012 99
  Heksansulfonat berikatan dengan analit-analit basa
seperti piridoksin dan tiamin membentuk pasangan ion.

 Pasangan ion yang bersifat netral tersebut bersifat lebih

hidrofobik dibanding bentuk unassociated protonated
amines  meng-hasilkan waktu retensi yang lebih lama.

 Reagen pasangan ion memfasilitasi parameter tambahan

yang sangat berguna bagi pemi-sahan analit basa dari
senyawa lain dalam sampel.

HPLC-2012 100
 Ion-pairing Reagent
 Selain ion-pairing reagent, amines modifier seperti trietil
amin sering ditambahkan ke fase gerak untuk
mengurangi peak tailing akibat interaksi kuat analit basa
dengan permukaan silanol yang bersifat asam.

 Untuk analit yang bersifat asam, sering ditambahkan ion-

pairing reagent seperti garam tetraalkilamonium.

HPLC-2012 101
 Answer :
Ionization of Silanols

Seny. Basa
HPLC-2012 102
 Amitriptilin

HPLC-2012 103
 Pada pH < 3
 Residu silanol (--Si-OH) pada kolom C-18 atau kolom
yang lain, akan tetap sebagai Si-OH.

 Sementara senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati

kolom akan terprotonasi menjadi R-NH3+ sehingga tetap
dapat berikatan dg Si-OH tetapi tidak terlalu kuat 
peak bagus (ramping) [ gambar 1: kiri ].

HPLC-2012 104
 Gambar: 1
HPLC-2012 105
 Pada pH > 3
 Residu silanol (--Si-OH) pada kolom C-18 atau kolom
yang lain, akan terion menjadi Si-O-.

 Sementara senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati

kolom akan terprotonasi menjadi
R-NH3+ sehingga akan berikatan kuat dg Si-O- dan peak
tailing [ gambar 1: kanan ].

Bagaimana mengatasi tailing tersebut ???

HPLC-2012 106
 Pengatasan Tailing Senyawa Basa
 Gunakan ion pairing reagent, seperti alkil sulfonat rantai
panjang, misal: sodium hexane sulfonat [ SHS ].

 SHS akan membentuk pasangan ion dengan senyawa

basa yang terprotonasi [ R-NH3+ ] , menghasilkan
pasangan ion yang netral dan lebih hidrofobik.

 Akhirnya akan dihasilkan waktu retensi yang lebih

panjang (senyawa basa dapat lebih terpisah dari senyawa
yang lain).

HPLC-2012 107
 Ion Pair Reagent
Alkylamines Alkylsulfonates

HPLC-2012 108
 Ion pairing Reagent

Mekanisme kerja pada pemisahan beberapa vitamin dan

senyawa lain, silahkan dibaca dalam buku:

Ahuja, S. and Dong, M.W., 2005,

Hanbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC

HPLC-2012 109
HPLC-2012 110
HPLC-2012 111
HPLC-2012 112
 Column Volume

HPLC-2012 113
HPLC-2012 114
HPLC-2012 115
HPLC-2012 116
HPLC-2012 117
HPLC-2012 118
 Universal buffer Mixture

HPLC-2012 119
 Validasi Presisi Metode Kromatografi
 Buat larutan uji (obat) dengan konsentrasi tertentu
( larutan A ).
 Lakukan penginjek-an berulang larutan A.
 Pada validasi metode analisis:
- minimum 10 kali injek ke sistem HPLC
- RSD < 1,0 % [direkomendasikan]
- untuk keperluan SST (UKS):
- RSD < 1,0 % untuk 3-5 kali injek
diperlukan.
 Beberapa metode mempersyaratkan nilai RSD < 2,0 %.

Ahuja dan Dong , 2005, p.278

VMA-2014 [ A ] 120
 Peningkatan Presisi HPLC

Ahuja dan Dong , 2005, p.265

VMA-2014 [ A ] 121
 Terima Kasih

E-mail: sudib_kekes@yahoo.co.id

HPLC-2012 122
 Terima Kasih

E-mail: sudib_kekes@yahoo.co.id

HPLC-2012 123
HPLC-2012 124