Spektrofotometri UV-Vis

D3 ANAFARMA
 Spektrofotometri

Ultraviolet:
 : 190 - 400 nm
Visibel (sinar tampak):
 : 400 - 700 nm
11/29/201 2
 Spektrofotometri UV

Dasar analisis:
• senyawa harus memiliki kromofor dan
auksokrom yang memadai

• kromofor adalah bagian molekul yang

bertanggung jawab pada penyerapan cahaya

• auksokrom adalah gugus fungsi yang memiliki

hetero atom dan menempel langsung pada
sistem kromofor

11/29/201 3
 Spektrofotometri Visibel

Dasar analisis:
- Senyawa asli/asal harus berwarna
- Bila senyawa asli tidak berwarna,
dapat diubah menjadi senyawa berwarna
dengan cara:
a. pembentukan senyawa komplek
b. memperpanjang kromofor

11/29/201 4
 Spektrofotometri

Analisis Kualitatif

11/29/201 5
11/29/2019 6
 Fenobarbital

C NH
H3C-H2C
C C O

C NH

11/29/201
O 7
Ultraviolet Spectrum

O
O
C NH
H3C-H2C C NH
H3C-H2C _
C C _O
C C O

CC NN

OO
 Fenobarbital
dalam larutan bufer pH 9,2
O Auksokrom

C NH
H3C-H2C
_
C C O

C N

O Kromofor
11/29/201 9
 Spektrum propil barbital

11/29/2019 10
 Spektrum propil barbital

C NH
H3C-H2C
Fenobarbital C C O

C NH

Propil barbital

11/29/201 11
 Spektrum propil barbital
O  max
C NH [ nm ]
H3C-H2C
Fenobarbital C C O
239
C NH 254
O

C NH
H2C=CH-CH2 241
C C O
H2C=CH-CH2 256
C NH

Propil barbital

11/29/2019 12
 Spektrofotometri

Analisis Kuantitatif

11/29/201 13
 Syarat Analisis Kuantitatif Secara
Spektrofotometri
Suatu Zat

Zat yang akan dianalisis harus memiliki

kromofor yang mencukupi [ Amati dari nilai
koefisien ekstingsi Molar-nya (  ) harus lebih
dari 1000 M-1.cm-1].

Larutan akhir sebelum diukur absorbannya

harus jernih. Bila tidat jernih  Terjadi
penghamburan sinar oleh partikel yang tidak
larut tersebut. Bgmn dengan nilai Abs. ?
11/29/201 14
 Dasar Analisis Kuantitatif

Hukum Lambert-Beer

 P0 
A = log10     logT
 P

A=bc
11/29/201 15
11/29/2019 16
 Mana yang lebih disenangi
pembacaan
Absorban atau Transmitan

11/29/201 17
 Mengapa pembacaan Absorban tidak
boleh lebih dari
satu

11/29/201 18
11/29/201 19
 Absorban vs indeks bias

εbcn
A 2
n 2 2
 
A = Absorban
ε = koefisien ekstingsi molar (M-1.cm-1)
b = tebal larutan (kuvet) (cm)
C = konsentrasi larutan (Molar, M)
n = indeks bias larutan
11/29/201 20
 The Magnitude of Molar absorptivity is 0 to around 105

 = 0.87 x 1020 x P x a
P: transition probability (0 to 1)
a: cross sectional target area in square centimeters
(for organic molecules, this number is around 10-15 cm2).

Forbidden transition, P = 0.01;  < 103

Allowed transition, P = 0.1 to 1
Weak absorption,  = 103 L/ (mol*cm)
Strong absorption,  = 104 to 105 L/ (mol*cm)
11/29/2019 21
 Untuk Analisis Kuantitatif

Senyawa yang
memiliki nilai koefisien ekstingsi molar [  ]

 ≥ 1000 M -1. cm -1

mudah dianalisis
secara spektrofotommetri

11/29/2019 22
Rumus Pendekatan

1%
A 1cm
Pada pelarut dan  tertentu
Rumus Pendekatan

A=bc

BM
= A 1%
1cm x
10
 PK. Ibuprofen, Spektro-UV

COOH

H3C CH3

CH3
BM = 206,3

11/29/201 25
 PK. Ibuprofen Spektro UV

1%
Pelarut A
1cm
( 265 nm )

Air-basa 18,5

11/29/201 26
 PK. Clonidin, Spektro-UV

BM = 230,1

11/29/2019 27
 PK. Clonidin, Spektro-UV

11/29/2019 28
 Teknik Kuantifikasi Analit
Menggunakan
Standar

11/29/2019 29
 Plot Standar Untuk Kuantitasi
 Dalam beberapa contoh di inndustri farmasi,
produk obat dibuat dengan berbagai kadar,
misal:
Tablet levotiroksin
dengan kadar:
50, 100, 150, 200, 500, dan 750 g

Untuk keperluan
mengembangkan dan memvalidasi metode
penetapan kadarnya,
dapat ditempuh tiga strategi:
11/29/2019 30
 1. Single-Point Calibration
 Digunakan satu macam konsentrasi standar
 Plot stndar yang dibuat, digunakan untuk
menetapkan semua kadar tablet
 Hal yang perlu diperhatikan adalah:
- metode ini perlu skema pengenceran dan
ekstraksi yang berbeda untuk kadar obat yang
bermacam-macam tersebut, dengan target:

Mendapatkan konsentrasi akhir serupa

Yang mendekati konsentarsi standar yang dibuat
[ Respon Berdekatan ]
11/29/2019 31
 Perbandingan Absorban

Absorban sampel
x Kadar baku = Kadar sampel
Absorban baku

Syarat:
Nilai Abs.baku dan Nilai Abs.sampel
berdekatan

11/29/2019 Chan dkk., 2004, p.14. 32

 2. Multiple-Point Calibration
 Digunakan seri konsentrasi standar yang dapat
mengkover semua kadar produk obat tersebut.
 Pda rentang konsentrasi tersebut, responnya
harus linear.
 Respon seluruh kadar obat (larutan akhir yang
akan dibaca) berada pada rentang respon
kurva kalibrasi.

Syarat:
Tidak diperbolehkan adanya Ekstrapolasi

11/29/2019 33
11/29/2019 34
 3. One Standard Calibration
for Each Strength

Digunaka satu konsentrasistandar

untuk
setiap kadar obat

Kapan Metode ini dipilih ?

Apabila analit tidak menunjukkan linearitas pada

rentang konsentrasi yang layak

11/29/2019 35
 Bagaimana Menghitung Kadar
 Dengan perbandingan nilai absorban sampel
terhadap nilai absorban baku [yang sudah
diketahui kadarnya]

Apa yang harus diperhatikan ?

 Dengan menggunakan kurva baku/persamaan

garis regresi linear.

Apa yang harus diperhatikan ?

11/29/2019 36
 Linearitas [ Menurut ICH, Q2(R1) ]
Chan dkk., 2004, p.14.

Linearitas
suatu metode analisis:

adalah kemampuan metode tersebut

(pada rentang tertentu)
untuk mencapai hasil uji yang berupa
variasi data
(misal: absorban, luas area kromatogram)
yang secara langsung proporsional terhadap
konsentrasi analit dalam sampel
11/29/2019 37
 Linearitas (lanjutan)

 Variasi data yang dapat untuk meng-

kuantifikasi analit dapat berupa:
- luas area kromatogram
- tinggi puncak kromatogram
- rasio antara luas area (tinggi puncak)
kromatogram analit terhadap luas area
(tinggi puncak) kromatogram standar
internal

11/29/2019 38
 Kuatitasi Analit
 Tergantung pada kepatuhan pemenuhan
hukum Beer
 Tergantung linearitas pada rentang konsen-
trasi tertentu

 Oleh karenanya:
- konsentrasi sampel kerja dan sampel yang
diuji untuk akurasi harus pada rentang yang
linear
.

11/29/2019 39
 Linearitas
 Biasanya ditunjukkan langsung dengan
pengenceran larutan baku stock.

 Disarankan linearitas dikerjakan dengan seri

pengenceran larutan stock.

 Tidak disarankan mempersiapkan seri konsen-

trasi larutan baku dengan seri penimbangan
zat standar, karena:

Terjadi kesalahan penimbangan

Tidak menjamin diperolehnya linearitas yang baik
11/29/2019 40
 Evaluasi Linearitas
 Paling baik dilakukan dengan pengamatan
secara visual plot respon (signal) sebagai
fungsi konsentrasi analit.

 Selanjutnya, variasi data umumnya digunakan

untuk menghitung persamaan garis regresi
dengan metode kuadrat terkecil ( Y = b X + a )

Syarat Linearitas:
Coeffcient of determination ( r2 ) ≥ 0.997

11/29/2019 41
 Rentang Linearitas [ ICH ]
 Penetapan bahan obat atau produk obat:

± 20 % target atau konsentrasi nominal

 Penetapan keragaman kandungan:

± 20 % target atau konsentrasi nominal

Pada rentang tersebut:

Paling tidak digunakan 5 (lima) macam tingkatan
konsentrasi
11/29/2019 42
 Persamaan Garis Regresi

11/29/2019 43
11/29/2019 44
11/29/2019 45
 Bagaimana Cara
Mengalisis Campuran
Dua Senyawa
???
11/29/2019 46
 Two-Component Mixture

X+Y

X Y

Example of a two-component mixture with little spectral overlap

11/29/2019 47
 Two-Component Mixture

X+Y
X

Example of a two-component mixture with significant spectral

11/29/2019
overlap 48
11/29/2019 49
11/29/2019 50
11/29/2019 51