SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

SPEKTROFOTOMETRI

 Didasarkan pada absorpsi (penyerapan) foton oleh

analit (zat yang dianalisis)
 Pada metode spektrofotometri, larutan sampel
menyerap radiasi elektromagne-tik dari sumber yang
cocok, dan jumlah yang diserap berhubungan
dengan kon-sentrasi analit dalam larutan.
 Spektrofotometri = Metode
 Spektrofotometer = Alat

2 2011, KA-II ke-1+2

 SPEKTROFOTOMETER
 Spektrofotometer merupakan alat yang
digunakan untuk mempelajari absorpsi atau
emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi
panjang gelombang.
SPEKTROSKOPI UV DAN VISIBEL

Spektroskopi UV
Panjang gelombang 200 – 400 nm
Untuk senyawa yang tidak berwarna

Spektroskopi visibel
Panjang gelombang 400 – 800 nm
Untuk senyawa yang berwarna alami
atau senyawa yang dibuat berwarna
SIFAT EKSITASI ELEKTRONIK

Jika radiasi EMR dilewatkan melalui suatu bahan yang transparan,

maka sebagian EMR akan diserap  spektrum absorpsi

Sebagai hasil dari penyerapan energi, maka atom atau molekul akan
dieksitasikan dari keadaan energi dasar (berenergi rendah) ke level
energi yang lebih tinggi (keadaan tereksitasi)

Proses ini bersifat kuantisasi yang berarti bahwa EMR yang diserap
mempunyai energi yang sama dengan perbedaan energi antara
keadaan dasar dan keadaan tereksitasi
TINGKAT ENERGY DAN TRANSISI

Dalam kebanyakan molekul obat, energi terendah yang

ditempati oleh orbital molekul adalah orbital sigma (σ),
lalu orbital phi, dan non bonding electron.
TINGKAT ENERGY DAN TRANSISI

Dalam hampir semua senyawa alkana, elektron-elektron

dapat menjalani beberapa jenis transisi pada energi yang
berbeda
ASAL MULA PITA SERAPAN Uv-Vis

Untuk atom, spektrum absorpsi berupa suatu garis

Untuk molekul, serapan absorpsi terjadi dalam kisaran

panjang gelombang yang luas sehingga pada umumnya
mempunyai berbagai bentuk eksitasi

S1
A
spektrum berupa
E Eksitasi
garis
elektronik

S0 
SPEKTRUM UV-VIS
SERAPAN UV-VIS

1. Adanya gugus-gugus penyerap (kromofor dan

auksukrom)
2. Pengaruh pelarut
3. Pengaruh Suhu
4. Pengaruh ion

• Kromofor adalah:bagian molekul yang bertanggung jawab pada

penyerapan cahaya.
• Kebanyakan kromofor memiliki ikatan tak jenuh.
• Auksukrom adalah atom atau gugus yang memapu meningkatkan
intensitas serapan UV-vis.
• Kebanyakan auksukrom mempunyai pasangan electron bebas.
ADANYA GUGUS PENYERAP
 KROMOFOR GUGUS BENZENA

2011, KA-II ke-3+4 12

AUKSUKROM

Auksukrom: gugus fungsi seperti -OH, -NH2, -OCH3 dan

halogen ( F, Cl, Br, I ) yang memiliki elektron valensi tak
berikatan dan tidak menyerap radiasi pada   200 nm
PERUBAHAN SPEKTRA UV-VIS
EFEK IKATAN RANGKAP TERKONJUGASI
PEMILIHAN PELARUT

• Pelarut yang digunakan pada penelitian

Spektrofotometri harus:
• dapat melarutkan sampel secara sempurna.
•
mentransmisikan sinar pada daerah panjang
gelombang yang diperiksa
• Perhatikan nilai UV-cut off.

2011, KA-II ke-3+4 16

 TRANSPARENCY LIMITS OF SOLVENTS IN
UV-VIS
Solvent Transparency
(high purity) Limit, nm
Acetone 330
Benzene 285
Carbon tetrachloride 265
Carbon disulfide 375
Chloroform 245
Cyclohexane 215
Dichloromethane 235
Dioxane 225

2011, KA-II ke-3+4 17

TRANSPARENCY LIMITS OF SOLVENTS IN
UV-VIS

Solvent Transparency
(high purity) Limit, nm
Ethanol 95 % 205
Ethyl ether 205
iso-Octane 215
Isopropanol 215
Methanol 215
Pyridine 305
Water 200
Xylene 295
18
SEKIAN
DAN
TERIMA KASIH
PENGARUH PELARUT PADA SPEKTRUM
FENOBARBITAL

C NH
H3C-H2C
_
C C O

C N

20
KARAKTERISTIK BAHAN KUVET
ASPEK KUALITATIF DAN KUANTITATIF
SPEKTOFOTOMETRI UV-VIS

Kualitatif
spektra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk
identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi jika
digabung dengan cara lain seperti IR, NMR, MS, maka
dapat digunakan untuk maksud identifikasi/analisis kualitatif
suatu senyawa tersebut.

Data yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah

panjang gelombang maksimal, intensitas, efek pH, dan
pelarut; yang kesemuanya itu dapat diperbandingkan dengan
data yang sudah dipublikasikan (Publissed data)
ASPEK KUANTITATIF

The fraction of light transmitted is thus I/I0. This fraction is defined as

the transmittance (T)
HUBUNGAN TRANSMITANS DAN
ABSORBANSI
 Hukum LAMBERT-BEER
Hukum ini merupakan dasar analisis kuantitatif dengan
spektroskopi (UV-Vis dan IR)

Hukum ini menyatakan bahwa absorbansi suatu larutan

berbanding lurus dengan konsentrasinya

A = εbc
A = absorban
ε = absorptivitas
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi (M)
Dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa
pembatasan yaitu:

 Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

 Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang
mempunyai penampang luas yang sama
 Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut
tidak tergantung terhadap yang lain
 Tidak terjadi peristiwa fluoresensi atau fosforisensi
 Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi
larutan.
Contoh perhitungan yang
melibatkan hukum Lambert-Beer
 ABSORPTIVITAS

Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan

panjang gelombang radiasi.

Satuan ε ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. Jika satuan c

dalam molar (M) maka absorptivitas disebut dengan absorptivitas
molar dan disimbolkan dengan ε dengan satuan M-1cm-1 atau
liter.mol-1cm-1.

Jika c dinyatakan dengan persen berat/volume (g/100 mL) maka

1%
absorptivitas dapat ditulis E 1cm

1% BM
ε = E 1cm x 10
 FUNGSI DARI NILAI E 11cm
%

 Untuk mendesain suatu prosedur dengan Uv-vis

 sensitifitas
Analisis kuantitatif dengan metode
spektrofotometri UV-Vis
1. Analisis komponen tunggal
2. Analisis 2 komponen
3. Analisis 3 atau lebih komponen (multi
komponen)
 Analisis komponen tunggal dengan
kurva kalibrasi
Perhatikan Hk. Lambert-Beer
A = εbc
Analisis komponen tunggal dengan
kurva kalibrasi
 Analisis komponen tunggal dengan
perbandingan absorbansi

Berdasarkan pada persamaan:

Asampel /Astandar = Csampel/C standar

Dengan demikian:
Csampel = (Asampel/Astandar) x Cstandar
 Contoh perhitungan
20 tablet ditimbang satu persatu untuk mengetahui
keseragaman berat tablet. Sebanyak 20 tablet furosemid
ditimbang sekaligus dan mempunyai berat 1,656 g. Serbuk
dengan berat 519,5 mg digojog dengan 300 mL NaOH 0,1N
untuk mengekstraksi furosemid yang bersifat asam, lalu
diencerkan sampai 500,0 mL dengan NaOH 0,1 M. Sejumlah
ekstrak disaring dan diambil 5,0 mL filtrat, lalu diencerkan
dengan NaOH 0,1 M sampai 250,0 mL. Absorbansi dibaca
pada panjang gelombang 271 nm terhadap blanko NaOH 0,1
N dan mempunyai absorbansi sebesar 0,596.

Nilai E 11cm
%
furosemid dalam basa pada panjang gelombang 271 nm = 580.

Kandungan furosemid yang dinyatakan terkandung tiap tabletnya adalah

40 mg).
 Contoh perhitungan
sebanyak 100,0 mg parasetamol ditimbang secara seksama lalu
dilarutkan dalam etanol. Larutan dimasukkan dalam labu takar
100 mL dan ditambah etanol sampai batas tanda. Sebanyak 0,5
mL larutan di atas diambil dan dimasukkan dalam labu takar 100
mL, dan ditambah etanol sampai batas tanda. Larutan ini
selanjutnya dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 249
nm terhadap blangko yang berisi etanol sehingga akan
didapatkan absorbansi larutan baku sebesar 0,310. Sebanyak
2,0 g serbuk sampel yang mengandung parasetamol dilarutkan
dalam etanol lalu dimasukkan ke dalam labu takar 250 mL dan
ditambah dengan etanol sampai batas tanda. Sebanyak 2,0 mL
larutan ini dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL dan ditambah
etanol sampai batas tanda. Sebanyak 2,0 mL larutan ini
selanjutnya diencerkan dengan etanol sampai 10,0 mL lalu
dibaca absorbansinya pada 249 nm dan mempunyai absorbansi
sebesar 0,245. Berapakah kandungan parasetamol dalam
serbuk di atas.
 Contoh perhitungan dengan
regresi
Sebanyak 2,0 g serbuk sampel yang mengandung fenasetin
dilarutkan dalam etanol lalu dimasukkan ke dalam labu takar
200 mL dan ditambah dengan etanol sampai batas tanda.
Sebanyak 5,0 mL larutan ini dimasukkan ke dalam labu takar 10
mL dan ditambah etanol sampai batas tanda lalu dibaca
absorbansinya pada 249 nm dan mempunyai absorbansi
sebesar 0,245. Berapakah kandungan fenasetin dalam serbuk
di atas jika persamaan regresi inier untuk hubungan antara
konsentrasi (sumbu x, dalam mg %) dengan absorbansinya
(sumbu –y) sebesar y = 0,102x+0,006
 Analisis Dua komponen
Didasarkan pada sifat aditif Hk. Lambert-Beer
Analisis Dua komponen
Contoh:
Nilai absorbansi obat A dengan konsentrasi 0,0001 M
dalam kuvet 1 cm adalah 0,982 pada λ 420 nm, dan
sebesar 0,216 pada λ 505 nm. Absorbansi obat B
dengan konsentrasi 0,0002 M adalah 0,362 pada λ
420 nm, dan sebesar 1,262 pada λ 505 nm.
Absorbansi campuran 2 obat adalah 0,820 pada λ
420 nm, dan sebesar 0,908 pada λ 505 nm.
Berapakah konsentrasi masing-masing obat A dan
obat B.
 Suatu campuran sediaan farmasetik mengandung
2 obat, sulfanilamida dan sulfatiazol. Spektrum
UV campuran 2 spektra akan tumpang suh
(overlapping). Sampel-sampel murni tiap obat
tersedia dan spektrum tiap obat diperoleh di
bawah kondisi yang sama. Dengan menggunakan
data yang terdapat dalam tabel di bawah, hitung
konsentrasi tiap obat dalam campuran.
Hal-Hal yang harus diperhatikan dalam
analisis spektrofotometri UV-Vis
1. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis

2. Waktu operasional (operating time)

3. Pemilihan panjang gelombang

4. Pembuatan kurva baku

5. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan

 1. PEMBENTUKAN WARNA
diazotasi

H3C N H3C N
O O
O O
H3C + NaNO2 H3C
HN S NH2 HN S N+ N
HCl Cl-
O O + 2H2O
Sukfisoksazol

HNO2 + HSO3NH2 → N2 + H2SO4 + H2O

Pengkoplingan

H3C N
O
O NHCH2CH2NH2
H3C
HN S N N +
+
O Cl-
+ 2H2O NED

H3C N
O
O
H3C N NHCH2CH2NH2
HN S N

senyawa berwarna
 2. Operating time
Absorbansi

waktu operasional

waktu pengukuran
3. Pemilihan panjang gelombang
Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
4. PEMBUATAN KURVA BAKU
 Dibuat dengan menghubungkan antara konsentrasi
(sumbu x) dengan absorbansi (sumbu y)
 Dibuat kurva baku antara konsentrasi vs absorbansi
5. Pembacaan absorbansi sampel
 Sampel dibaca dan akan diperoleh absorbansi
 Nilai absorbansi yang diperoleh dimasukkan ke
persamaan kurva baku
 Diperoleh konsentrasi analit dalam sampel
Sistem Instrumentasi
Sumber sinar (lampu)
 Lampu deuterium digunakan untuk daerah UV
pada λ 190-350 nm. Lampu halogen kuarsa atau
lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (λ
350-900 nm).

 Penggunaan lampu UV-Vis harus dicatat dengan

baik (perhatikan life time-nya)
Monokromator
 digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam
komponen-komponen panjang gelombangnya
yang selanjutnya akan dipilih oleh celah (slit).

 Monokromator berputar sedemikian rupa

sehingga kisaran panjang gelombang dilewatkan
pada sampel sebagai scan instrumen melewati
spektrum
Optik-optik
 Dapat didesain untuk memecah sumber sinar
sehingga sumber sinar melewati 2 kompartemen,
dan sebagaimana dalam spektrofotometer berkas
ganda (double beam), suatu larutan blanko dapat
digunakan dalam satu kompartemen untuk
mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel.

 Yang paling sering digunakan sebagai blanko dalam

spektrofotometri adalah semua pelarut yang
digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi.
Kalibrasi Spektrofotometer UV-Vis

 Kalibrasi Skala Absorbansi

 Kalibrasi Skala Panjang Gelombang
 Penentuan Resolusi (Daya Pisah) Spektrofotometer
 Penentuan Adanya Sesatan Sinar (Stray Radiation)
 Kalibrasi Skala Absorbansi

 kalium bikromat 0,0005% dalam H2SO4 digunakan

untuk mengkalibrasi skala absorbansi pada
spektrofotometer UV

 Nilai pada daerah panjang gelombang

1%
Eharus terletak pada kisaran absorbansi
tertentu 1cm

tertentu.
Spektrum UV larutan kalium dikromat 0,0005% pada
panjang gelombang antara 220 – 350 nm
E 11cm
%

 (nm) Nilai E 11cm

%

235 122,9 – 126,1

257 142,4 – 145,7

313 47,0 – 50,3

350 104,9 – 108,2

Kalibrasi Skala Panjang Gelombang

 Skala panjang gelombang pada spektrofotometer UV-

Vis dicek dengan menentukan panjang gelombang
maksimal spesifik dari suatu larutan holmium perklorat
5% b/v

 Toleransi untuk kalibrasi panjang gelombang adalah 241

 1 nm; 287,15  1; dan 361,5  1 nm.

 Skala panjang gelombang dapat juga dicek

menggunakan garis spektra lampu deuterium atau
lampu merkuri.
Absorbansi maksimal larutan holmium perklorat 5%
pada λ antara 200 – 400 nm
Penentuan Resolusi (Daya Pisah)
Spektrofotometer

 Daya pisah spektrofotometer biasanya dikontrol

dengan lebar celah.

 Daya pisah spektrofotometer dapat diuji dengan

menggunakan larutan toluen 0,02% b/v dalam
heksan.

 Farmakope Inggris mensyaratkan bahwa rasio antara

absorbansi larutan ini pada 269 nm terhadap
absorbansi pada 266 nm harus  1,5.
Penentuan Adanya Sesatan Sinar
(Stray Radiation)
 Sesatan sinar adalah sinar yang sampai ke detektor
akan tetapi tidak melewati sampel.
 Adanya sesatan sinar ini akan memberikan
pembacaan absorbansi yang rendah tapi palsu
terhadap suatu sampel, karena seolah-olah sampel
hanya menyerap sedikit sinar daripada yang
seharusnya.
 Keadaan seperti ini menjadi lebih serius jika suatu
sampel mempunyai absorbansi  2.
Sesatan sinar dapat dicek dengan mengukur absorbansi
larutan KCl 1,2% b/v dalam air terhadap blanko air
pada panjang gelombang 200 nm.

Jika absorbansi larutan ini kurang dari 2 maka terjadi

sesatan sinar dan spektrofotometer harus diganti.
Spektra UV Untuk Beberapa
Molekul Obat
Efedrin: Suatu Kromofor Tipe
Benzoid
Ketoprofen: Kromofor Benzen Yang
Diperpanjang

O CH3

C CH COOH

Ketoprofen
Prokain: Auksukrom gugus amino
Fenileprin: Auksukrom Gugus
Hidroksil