Pengembangan

Metode Analisis
dengan KCKT
Hilda Aprilia, M.Si., Apt.
Panduan
memperpanjang
umur kolom
Pengaruh polaritas fase gerak pada retensi dalam
KFN dan KFB
Utk suatu analit :
Log k’2/k’1 = ½ (P’1 – P’2)

k’B < k’A, tRB < tRA

Fase diam: polar

Fase Normal
Fase gerak: kurang polar

Fase Balik Fase diam:kurang polar

Fase gerak: polar

k’A > k’B, tRA > tRB

Utk suatu analit :

Log k’2/k’1 = ½ (P’2 – P’1)
 Dasar Perhitungan
• Faktor retensi didefinisikan sebagai :
k’ = (tR – tM)/tM dan tR = (k’ + 1)tM
• Indeks polaritas campuran pelarut didefinisikan
sebagai :
P’AB = φAP’A + φBP’B
• Perubahan polaritas fase gerak terhadap faktor
retensi adalah :
1. KFN
log (k’2/k’1) = ½ (P’1 – P’2)
2. KFB
log (k’2/k’1) = ½ (P’2 – P’1)
 LATIHAN SOAL

Senyawa A dalam suatu sediaan

farmasi dianalisis dengan
menggunakan HPLC fase balik,
kolom C-18; fase gerak =
Metanol : Air = (7 : 3) (v/v)
dengan nilai faktor kapasitas
kolom sebesar 8. Hal ini
menyebabkan nilai waktu
retensi cukup besar dan run
time analisis cukup lama. Untuk
memperbaikinya maka nilai
faktor kapasitas harus diubah
menjadi diantara 2 dan 5.
Berapakan perbandingan fase
gerak yang baru sehingga waktu
analisis bisa sesuai dengan yang
diharapkan?
 Pengaruh pH fase gerak terhadap k’
1. Senyawa asam (ionisable) :
k’app = k’/(1 + 10(pH – pKa))
2. Senyawa basa (ionisable) :
k’app = k’/(1 + 10(pKa – pH))
Dimana k’app adalah faktor retensi k’ pada pH
yang dimaksud
Catatan :
• tR adalah waktu retensi analit yang dimaksud
• tM adalah waktu retensi analit yang tidak
diretensi (k’ = 0)
• P’AB adalah indeks polarutas campuran pelarut A
dan pelarut B
• ΦA dan φB adalah fraksi volume pelarut A dan B
• K’1 dan k’2 adalah faktor retensi awal dan akhir
dari suatu analit
• P’1 dan P’2 adalah indeks polaritas fase gerak awal
dan akhir
 LATIHAN SOAL
• Sebuah analisis dengan HPLC fase balik
menggunakan fase gerak Asetonitril : tris HCl
buffer pH 7.4. Analisis dilakukan terhadap tiga
senyawa yaitu bupivakain (pKa = 8.1);
pilocarpine (pKa = 7) dan procaine (pKa = 9).
• Tentukan mana senyawa yang terelusi lebih
dulu dan mana yang terelusi lebih lambat?
Panduan pemilihan kolom dan fase gerak
Teknik, kolom dan fase gerak
a. KFB
Kolom : C-18, C-8, fenil, siano
Fase gerak : Air : metanol; air : asetonitril
Pengubah : larutan asam/basa/dapar
b. KFN
Kolom : silika, diol, amino, siano
Fase gerak : campuran pelarut organik
non polar
Pengubah : metanol, etanol
c. Kromatografi pasangan ion
Kolom : C-18, C-8
Fase gerak : Air : metanol; air : asetonitril
Pereaksi : pasangan ion dan dapar
Penggunaan untuk sampel
Senyawa netral dan tidak terionkan
yang larut dalam salah satu
komponen fase gerak (air, metanol
atau asetonitril)
Senyawa lipofilik yang tidak larut air
Campuran isomer
Jika KFB dan KPI tidak efektif dapat
digunakan untuk senyawa netral
Senyawa ionik
Senyawa organik dapat terionkan
(asam, basa, atau garam)
 Kromatografi pasangan ion dan
penekanan ion

• Senyawa ionik tidak dapat diretensi oleh kolom/fase diam

non polar, ia akan terelusi secara spontan. Masalah ini
dapat diatasi dengan menggunakan kromatografi pasangan
ion (KPI)
• Senyawa ionik terprotonasi akan bereaksi dengan pereaksi
pasangan ion membentuk spesi molekul yang netral. Spesi
netral ini akan diretensi oleh fase diam, dan terelusi lebih
akhir
• KPI menggunakan kolom fase balik (C-18 atau C-8) dengan
fase gerak campuran air-metanol atau air- asetonitril
dengan tambahan pereaksi pasangan ion dan dapar
tertentu
• Sedangkan senyawa organik obat yang dapat terionkan
seperti asam atau basa akan memberikan
kromatogram yang tidak simetris
• Masalah ini dapat diatasi dengan proses penekanan
ionik dengan pengaturan pH yang sesuai sehingga
ionisasi tidak terjadi dan dalam sistem terbentuk
molekul utuh dari asam atau basa. Molekul utuh asam
atau basa ini akan diretensi yang memadai sehingga
terelusi dalam bentuk kromatogram yang lebih simetris
• Sistem yang digunakan sama dengan KFB dengan
menambahkan larutan asam atau basa ke dalam fase
gerak sehingga pHnya cukup memadai (pKa=3)
• Buffer disetting pada kurang lebih 1 unit pH dari pKa
senyawa yang dianalisis
• Pereaksi pasangan ion yang umum :
1. Asam alkil sulfonat (asam pentan, heksan, heptan
atau oktan sulfonat) pada pH sekitar 3 sampai 5,
untuk senyawa kation atau garam basa organik
2. Tetrabutil amonium atau dibutil amonium pada pH 7-
8, untuk senyawa anion atau garam asam organik

• Faktor yang harus diperhatikan :

1. Panjang rantai alkil
2. Konsentrasi pereaksi pasangan ion
3. Kandungan pelarut organik dalam fase gerak
4. pH fase gerak agar analit dalam bentuk terprotonasi
saja yang akan bereaksi dengan pereaksi pasangan ion
 Kriteria Penentuan Kondisi Percobaan dan
Kesesuaian Sistem
Parameter percobaan Kriteria
Tekanan 100 – 200 bar
Faktor kapasitas 1 < k’ < 10
Faktor selektivitas α >1
Efisiensi kolom N ≥ 10.000/m
Resolusi R ≥ 1,5
Faktor ikutan/simetris Tf = 1
Laju aliran 1 – 2 mL/menit
Keberulangan Koefisien variasi < 2%
Waktu pemisahan 1 – 20 menit
Kromatogram Lancip, tajam, dan tidak berekor
Penggunaan pelarut minimal
 Panduan memilih metode
kromatografi
1. Informasi sampel dan analit sdh lengkap? Bila belum, lakukan penelusuran
pustaka
2. Pemisahan sejenis sudah dilakukan terhadap analit dalam sampel, bila sudah
dipelajari dan adopsi cara pemisahan tersebut
3. Sampel dan analit menguap, pilih KG. Kalau tidak menguap lakukan
derivatisasi dulu sebelum KG.
4. Analitnya larut dalam komponen fase gerak dan mengandung kromofor,
gunakan cara KC dengan detektor UV, bila tidak lakukan derivatisasi atau pilih
detektor yang sesuai (indeks bias, elektrokimia, dll)
5. Bobot ukuran analit > 2000, pilih KPG atau KEU
6. Bobot molekul < 2000
a. larut dalam pelarut organik : KEU atau KFN
b. larut dalam air : KFG, KPuI, KFB
Ermer, J. and P. Nethercote. 2012. Methods Validation on Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best
Practice. 2nd edition. Wiley-VCH.
 Flowchart
Optimasi
Metode
Analisis
dengan KCKT

Ermer, J. and P. Nethercote. 2012. Methods Validation on Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best
Practice. 2nd edition. Wiley-VCH.
Ermer, J. and P. Nethercote. 2012. Methods Validation on Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best
Practice. 2nd edition. Wiley-VCH.