HPLC

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Application And Marketing Support

PT. Ditek Jaya
2012
 Introduction

Teknik analisis pemisahan, yang digunakan untuk

keperluan , seperti :
• Analisis kualitatif
• Analisis kuantitatif
• Pemisahan / isolasi
• Pemurnian
 Prinsip dasar HPLC

Proses adsorpsi dinamis, molekul analit bergerak

melalui celah berpori.
Adanya perbedaan interaksi antara material
kolom dan komponen-komponen, sehingga
pemisahan dapat terjadi.
Semakin kuat interaksi tersebut maka akan
semakin lama retention time pada senyawa
tersebut
 Mobile Phase
Variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang
sangat luas pada solven yang digunakan untuk HPLC, tetapi ada
beberapa sifat umum, yaitu fasa gerak harus :
1. Inert, Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
2. Kelarutan, zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik
untuk cuplikan yang akan di analisis.
3. Kemurnian, zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan
masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi
kromatogram.
4. Kejernihan, zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan
penyumbatan pada kolom.
5. Detektor kompatibilitas (Sesuai dengan detektor).
6. Viscositas rendah. 
 Stasionary Phase
• Pemisahan HPLC didasarkan pada interaksi permukaan, dan
tergantung pada jenis dari situs absorpsinya.
• HPLC modern menggunakan fase diam dengan partikel pori yang
kecil dan rigid, dengan surface are yang tinggi
Parameter utama untuk fase diam
1. Particle size 3-10 um (untuk UHPLC digunakan dengan <2 um)
2. Distribusi particle sesempit mungkin
3. Tipe ligand pada permukaan juga mempengaruhi pemisahan
Normal phase : dengan gugus –OH dan – NH2
Reserved phase : dengan gugus C4; C8; C18
Penukar anion : CH2NR3+OH-
Penukar kation : R-SO3-H+
 Mengapa pilih HPLC ?
1. Dapat dilaksanakan pada suhu kamar.
2. Cepat dan mudah melaksanakannya.
3. Pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali
demikian juga dengan kolomnya.
4. Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan
bahan yang di analisis.
5. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak
mudah menguap dan termolabil.
 Sample yang dapat dianalisis
• Sample berbentuk cair
• Sample harus homogen
• Sample Bebas dari padatan
• Sample non volatile
• Sample tahan terhadap tekanan tinggi

7
 Bidang aplikasi HPLC
• Farmasi
• Forensik
• Makanan
• Lingkungan
• Pigmen

8
Diagram Alir HPLC

Sample
injection

waste detector
 Normal Phase
Senyawa Pemakaian
Fase diam : Polar
(Silika, Cyano, Amino,Diol)
Silika / Cyano Pemakaian secara
Fase gerak : non polar umum
(Hexane / Heptane dengan
Amino (-NH2) Analisa gula
dicampurkan solven yang
sedikit polar seperti IPA / EA)
Diol (-SH) Analisa Protein

Analit yang polar akan terelusi

terlebih dahulu, sedangkan
analit yang lebih polar akan
terelusi belakangan
Penambahan Fase Gerak Polar pada Fase
normal

Fase Gerak
95 % Hexane : 5 % Methanol

Fase Gerak
98 % Hexane : 2 % Methanol

Fase Gerak
100 % Hexane
 Fase terbalik HPLC
Fase diam : non polar
(ODS, oktyl,butyl)
Fase gerak : polar
(air atau solven organik polar seperti methanol
maupun asetonitril)

Analit yang lebih polar akan terelusi terlebih dahulu,

sedangkan analit yang polar akan terelusi belakangan
Penambahan Fase Gerak Polar
pada Fase Terbalik

Fase Gerak
40 % Methanol : 60 % H2O

Fase Gerak
70 % Methanol : 30 % H2O

Fase Gerak
80 % Methanol : 20 % H2O
Pengaruh jenis kolom pada sample yang sama

Kolom ODS akan berinteraksi kuat

dengan sample

Kolom C-8 akan berinteraksi

sedang dengan sample

Kolom C-4 akan berinteraksi lemah

dengan sample
 Sistem Instrumntasi HPLC
• Mobile phase reservoir, filter
• Solven Delivery Unit (Pompa)
• Injector
• Kolom
• Detector
• Sistem data
 Auto rinsing kit
• Auto rinsing kit digunakan untuk
memperpanjang usia dari planger seal,
karena secara otomatis akan membersihka
planger seal pada saat bekerja
 Injector
• Saat dimana sample dimasukan/diinjeksikan
untuk didorong bersama fase gerak
• cuplikan yang dimasukkan harus sekecil
mungkin (beberapa puluh mikroliter).
• Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak
menurun ketika memasukkan cuplikan ke
dalam aliran fasa gerak
Sample Rack Control Rack

Inside of SIL-20AC
 Column
• Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada
pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.
• Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel
walaupun ada juga yang terbuat dari gelas berdinding
tebal. tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi
komponen-komponennya.
• Banyak keuntungan menggunakan kolom dengan
ukuran partikel yang kecil, yaitu dapat mempercepat
waktu analisa

27
 Kinerja kolom
• Teoritical plates (umumya minimal 2000)
• Tailing factor (umumnya maksimal 1.5)
• Resolusi (umumnya minimal 1.5)
• Faktor kapasitas (umumnya bergantung pada masing masing
rule)
• Efisiensi kolom (HETP merupakan jarak antara plat-plat
teoritis)
 Nilai nilai dari parameter tersebut harus memenuhi persyaratan
dari standart masing masing acuan rule yang digunakan,
 Seperti farmasi mengacu pada USP. EP, JP, BP dll
 Column Oven
• Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik

• Limit atas temperature dapat diatur sebagai

fitur keamanan.
• Sensor kebocoran secara otomatis mematikan
oven jika terdeteksi adanya uap organik.
 Sistem HPLC
Isokratik Gradien

• Komposisi fase gerak • Komposisi gase gerak

konstan berubah
• Mixing fase gerak ofline • Mixing fase gerak online
• Tidak efisien untuk riset • Efisien untuk riset
 Elusi Gradien
• Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan
fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung.
• Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada
kolom.
• Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
1. Total waktu analisis dapat direduksi
2. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam
campuran bertambah
3. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
4. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi
pada peak
 HPLC Gradient
Low Pressure High Pressure
• Membutuhkan satu • Membutuhkan lebih dari
pompa (LC 20 AD/AT) satu pompa (minimal 2
• Membutuhkan LPGE unit pompa)
untuk menarik 4 fase • Mampu menarik lebih
gerak secara bergantian dari 1 fase gerak secara
• Perbandingan fase gerak bersamaan
90:10 • Perbandingan fase gerak
sampai 99:1
 Low Pressure Gradient
LPGE
unit B
A C
D

33
 High Pressure Gradient

34
 Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel
di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya
(analisis kuantitatif).
1. Cukup sensitive
2. Stabilitas dan keterulangan tinggi
3. Respon linear terhadap solute dan kisar respons linier yang
luas
4. Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan
alir dan memberi respons untuk semua tipe senyawa
5. Realibilitas tinggi dan mudah digunakan
6. Tidak merusak cuplikan
7. gangguan (noise) yang rendah
 Jenis detektor
• UV-Vis
• Reflective Index
• Fluorescence
• Electrochemical
• Conductivity
• Mass-spectrometric (LC/MS)
 Flow cell yang tersedia
• Standard SUS flow cell
• Flow cell untuk sistem inert .
• Flow cell untuk semimicro LC
• Flow cell untuk preparative LC
• Flow cell untuk fast LC
• Cell dengan toleransi tekanan tinggi (up to 400
kgf/cm2)  untuk digunakan dengan SFC
menggunakan packed column dan LC-MS.
UV-VIS
Diode array detector -
polychromator
 Photo Diode Array Detector
• Sangat baik untuk riset dan pengembangan
• Menggunakan D2 lamp dan W lamp
sebagai sumber sinarnya (190-800 nm)
Fluorescence Detector
 Fluorescence Detector
• Untuk analisa zat yang membutuhkan
sensitifitas tinggi yang tidak terbaca pada
detektor UV-Visible [ppb level].
• Menggunakan prinsip serapan dan emisi
eksitasi senyawa yang berfluoresensi dengan
sumber cahaya lampu xenon.
• Menggunakan detektor Photomultiplier [PMT].
• Contoh analisa : Residu Pestisida, Residu
Antibiotik, Asam Amino dalam infus, dll.
Chromatogram
Top: UV-Vis
Bottom: Fluorescence

Hence, fluorescence is more

selective and sensitive due to
noise reductions
Reflactive Index Detector
Refractive Index Detectors (RID)
• Untuk analisa karbohidrat, sistem GPC.
• Menggunakan prinsip deteksi perbedaan
sudut bias cahaya antara reference dan
sample dengan sumber cahaya lampu W.
• Menggunakan detektor Silicon Photo Cell
[SPC].
• Contoh analisa : Sukrosa, Fruktosa, dll.
Chromatogram RID
Conductivity Detector
 Conductivity detector Principle (CDD)

• Untuk analisa asam-asam organik sangat

sensitif
• Konduktifitas dipengaruhi oleh temperatur

 Menggunakan suatu elektroda

 Menggunakan ampermeter dan voltmeter untuk
mengetahui nilai kondiktifitas listrik
 Application
• Sensitivitas untuk senyawa fenol,
catecolamines, nitrosamine dan asam
organik dalam ukuran pikomol (nano gram).
• Fase gerak harus dibuat konduktif elektrik,
biasanya dengan penambahan garam yang
sesuai
Chromatogram
 Mass Spectrofotometer
• Detector yang dapat mengetahui beberapa
informasi yang lebih akurat seperti
1. Keakurasian berat molekul,
2. Informasi struktur,
3. Menentukan rumus dari molekul kecil
4. Menentukan rumus dari molekul paling
besar
 LCMS
• Merupakan HPLC menggunakan detector
MS (Mass Spectrofotometer)
• Hasil pemisahan menggunakan HPLC agar
analisa sample lebih akurat karena
memfragmenkan ion-ion hasil pemisahan,
dimana perbedaan massa ion hasil
fragmentasi tersebut yang menjadi acuan
konfirmasi kualitatif.
 Keuntungan LCMS
• Setiap komponen memiliki spectrum
fragmentasi ion yang khas sehingga dapat
digunakan sebagai konfirmasi kualitatif
selain waktu retensi [RT].
• Hal ini karena RT tidak khas dimiliki oleh
komponen.
 Konfigurasi LCMS

Interface

• eluent / solvent  Menghilangkan  Kondisi Vakum

organik solvent [fasa
gerak]
•Non-volatile  Analisa Ion, m/z
 Ionisasi analit
senyawa analit
 Molecular
Weight

ESI

10,000

1,000 APCI

APPI
100 EI (GCMS)

Non-polar Polarity Very polar